物种特异性和保守性DNA序列筛选及其在畜产品种源成分鉴定中的应用

发布时间：2020-06-14 23:02

【摘要】：动物源性成分是一类来源于动物具有种属代表性的物质,可以是核酸、蛋白,也可以是各种脂类和小分子物质等。近年来,各种畜产品的掺假掺杂事件层出不穷,欧洲马肉风波‖、中国假羊肉事件‖等肉类掺假事件,饲料中非法添加反刍动物成分引起的疯牛病全球性传播等,这些畜产品安全问题严重影响肉类市场秩序和畜牧业的健康发展。对食品和饲料中动物源性成分的定性、定量检测是解决这一问题的重要技术手段。目前主要的检测方法是基于线粒体DNA(mtDNA)的PCR方法。然而,由于mtDNA在组织和个体间的拷贝数差异和碱基高变异性,使其易出现假阴性检测结果,且难以实现准确的定量,因而迫切需要筛选新的物种特异性的DNA序列。此外,肉类掺假检测中多物种通用内参的缺乏或保守性差等问题也影响畜产品定量检测的准确性。本研究利用动物全基因组序列和转录组信息,通过比较基因组学分析策略分别筛选物种特异性核DNA序列和多物种保守的核DNA序列,建立肉和饲料中多种动物源性成分的定性、定量检测方法。为满足畜产品安全监管部门对动物源性成分鉴别的系统化、多元化、快速化的迫切需求提供技术支撑。取得的主要结果如下:1.物种特异性DNA序列的筛选及其分子特征分析为了获得新的物种特异性DNA序列,本研究基于物种的全外显子序列,以独创的动态E-value结合Identity%、Quary-cover%为筛选条件,通过与Nt数据库、非目标物种基因组和目标物种基因组的3次本地BLASTN序列比对分析,根据物种的分类地位,在11个科的19个物种中筛选各物种特异性外显子。随后,将各物种的特异性外显子分为完全特异的外显子序列(CESS)和部分特异的外显子序列(PESS),并对其进行分布、结构和序列特征的分析发现:物种的特异性外显子占物种总外显子的比例很低,且与染色体的大小无关。其中的CESS主要分布在CDS区,且序列内部含有大量重复元件;长度较短的、高GC含量的外显子更易发生片段的完全缺失或增加,且其形成与序列上下游的同向重复序列以及序列内部的短重复序列有关。进一步利用各物种特异性DNA序列设计引物,并在19个物种中进行PCR检测,验证了序列和引物的物种特异性,实验结果说明筛选的物种特异性DNA序列可作为种源成分检测的靶标。2.基于物种特异性DNA序列建立肉制品及动物源性饲料中种源成分的定性PCR检测方法为了解决种源检测中靶序列单一匮乏、特异性和保守性差等问题,基于筛选获得的物种特异性DNA序列,建立了肉制品中牛、羊、猪、鸡和鸭源性成分的定性PCR检测方法。通过在线BLAST和ClustalW多序列比对分析,将物种特异性DNA序列分别与包含动物、植物和微生物在内的4个界、11个纲、21个目、36个科、47个属的53个代表性物种的参考基因组进行序列比对分析,发现各序列均具有高度的种间特异性和种内保守性。通过物种特异性引物设计并进行反应体系、反应条件优化,建立了5个物种5对引物相同反应程序(退火温度均为60℃)的PCR检测方法,实现了肉中牛、羊、猪、鸡、鸭成分的同时检测。所建立的PCR检测方法在19个物种中进行验证,结果表明5个物种的种源检测PCR方法具有高度的物种特异性,仅在目标物种中具有扩增产物,其他物种中无任何产物;同时利用5个物种的44个个体进行PCR扩增都得到预期的扩增产物,通过对PCR产物进行测序,在同一物种中的序列具有一致性,说明这些物种特异性序列在物种内具有高度的保守性。所建立的PCR检测方法,灵敏度均可达到0.5ng。进一步对牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和鸭肉的熟肉制品进行检测,得到与产品种源成分一致的检测结果,说明本方法可用于加工肉食中种源成分的检测。针对疯牛病的饲料源性传播问题,筛选了牛科特异性基因TAF4,该基因在牛和羊中存在18bp片段差异,针对该差异片段设计一对牛羊通用引物,但扩增产物大小不同,通过一次PCR反应即可同时检测和鉴别牛(125bp)、羊(107bp)源性成分,并在23个物种中表现出高度的物种特异性。对牛(黄牛、牦牛、瘤牛、水牛)、羊(绵羊、山羊)不同品种进行PCR扩增和测序比对分析,结果表明该序列在牛、羊中都分别具有高度保守性。所建立的PCR检测方法,灵敏度可达到0.2ng DNA。最后,对5份委托制作的动物源性饲料的检测结果说明该方法具有检测饲料样品中牛、羊源性成分的能力,具有重要的应用价值。3.筛选哺乳动物和鸟类中高度保守的单拷贝序列作为多物种通用内参并建立定量检测方法定量检测是对畜产品掺假情况进行准确评估的一个重要方法。而可靠有效的定量内参是解决这一问题的前提。本文从全基因组水平出发,利用11个科的13个哺乳动物和鸟类物种的外显子数据,通过比较基因组学和生物信息学方法筛选了在哺乳动物和鸟类中同源率95%的高度保守的核DNA序列,并在保守区设计了多物种通用引物。通过在18个动物物种基因组中试验验证发现,该序列具有高度保守性、且为单拷贝序列。基于多物种定量内参,进一步建立和优化了一种种源成分定量检测方法,相对误差(R.E.)和相对标准偏差(R.S.D.)均小于25%。并通过引入基因组当量(GE)和校正系数k的概念,实现了DNA混合样品中牛、兔、狗、狐、貂成分的更加精准的定量检测。为畜产品中种源成分的准确定量提供了可靠的多物种通用的定量内参和检测方法。4.基于多物种通用内参建立肉制品中多种动物源性成分的多重定量检测方法针对欧洲马肉风波‖问题,结合牛、马的特异性DNA序列和多物种通用内参,建立了牛(223bp)、马(197bp)和动物(129bp)源性成分的三重定性和定量检测方法;针对我国假羊肉事件‖,结合羊、狐、鼠的特异性DNA序列和多物种通用内参,建立了羊(237bp)、狐(211bp)、鼠(160bp)源性成分的多重定性和定量检测方法。所有物种特异性序列均与包含动物、植物、微生物在内的53个物种的参考基因组进行BLAST和ClustalW序列比对,并在碱基差异区设计物种特异性引物和探针。利用普通PCR和TaqMan荧光PCR在多个物种DNA中对序列、引物和探针的特异性进行验证,并进而验证了各物种特异性序列均为固定拷贝数的序列。多重PCR体系的建立说明各组引物和探针之间不存在交叉互作,确保了单一体系中多种种源成分的同时检测和定量。保守性试验表明各物种特异性序列和引物在各自目标物种内的高度保守性。灵敏度检测结果表明检出限(LOD)为0.05ng DNA,定量限(LOQ)达5%。并通过构建各物种特异性序列和内参序列的标准曲线,建立了GE与Ct值的计算关系,对多组DNA混合样品和不同质量比的混合肉样品进行多重定量检测,R.E.和R.S.D.均小于25%,表明所建立的多重定量检测方法的具有良好的检测准确度和精确度。本研究利用比较基因组学方法筛选物种特异性核DNA序列用于种源成分检测;筛选保守性核DNA序列作为多物种定量内参。进而建立了肉和饲料中牛、羊、猪、马、鸡、鸭、狐等多种种源成分的定性和定量检测方法,为种源成分检测提供了相应的方法和候选素材,为食品和饲料安全提供重要的技术支撑。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S816.17;TS251.1

【参考文献】