运输应激对生猪空肠组织氧化损伤和细胞自噬的影响

发布时间：2020-06-15 22:33

【摘要】：肠黏膜上皮细胞结构和功能的完整性在动物生长发育、免疫防御、营养代谢等方面发挥重要作用,肠道作为应激反应的主要器官,容易受多种不利因素的影响导致氧化应激和肠道损伤,破坏肠黏膜上皮细胞的完整性,为相关疾病的发生提供可能。细胞自噬是以细胞质空泡化为特征的溶酶体依赖性的蛋白质降解途径,在维持细胞结构和功能的完整性、调节氧化应激缓解细胞损伤中发挥重要作用。运输是生猪养殖和屠宰中重要的环节,运输应激容易导致生猪死亡、疾病发生和屠宰效率下降,严重影响生猪养殖的经济效益。因此,探讨运输应激对生猪肠道结构和功能的影响,分析其发生机制对采取有效措施缓解运输应激,提高屠宰效率具有重要意义。本研究主要探究运输应激对生猪肠道损伤和细胞自噬的影响,利用RNA-Seq技术筛选肠道损伤的差异基因及信号通路,并从细胞水平分析差异基因对肠黏膜上皮细胞氧化损伤和细胞自噬的调节作用,为阐明运输应激的作用机理及调控机制提供理论依据。主要研究结果:1.运输应激对生猪空肠氧化损伤及细胞自噬的影响将16头体重在100±5 kg的育肥猪((大白×长白)×杜洛克)随机分成两组,对照组直接运至屠宰场并休息24 h,实验组运输5 h并立即屠宰,收集血液和空肠组织,检测血清MDA、LDH、SOD、LPS含量,利用HE染色分析空肠形态,通过QPCR和Western Blot技术分析NOX1、HO-1、紧密连接蛋白、自噬相关蛋白、PINK1和Parkin等蛋白表达水平。结果表明,运输能够引起生猪空肠绒毛破损、脱落、长度变短,隐窝加深;血清中MDA、LDH和内毒素LPS水平升高,SOD水平降低;空肠组织中HO-1以及紧密连接蛋白(Claudin-1、Occludin和ZO-1)表达下调,NOX1 mRNA表达上调;运输应激可以增加自噬相关蛋白(LC3、ATG5)的表达,并激活PINK1/Parkin通路依赖的线粒体自噬水平。表明运输应激可导致生猪肠道氧化损伤并激活细胞自噬和线粒体自噬水平。2.运输应激对生猪空肠组织基因转录水平的影响提取空肠组织RNA,利用RNA-Seq技术筛选差异表达基因,并对其进行GO、KEGG和蛋白互作分析,同时利用QPCR验证测序结果的准确性。与对照组相比,运输应激组共有1036个转录本差异基因(FC1.5,FDR0.05),其中606个基因上调,430个基因下调;GO功能注释显示差异基因表达主要与G-蛋白偶联受体信号传导、防御反应、细胞因子作用、脂质催化过程、膜的整体组成、细胞外区域等有关;KEGG通路富集主要与MAPK信号传导途径、PI3K-Akt信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞凋亡、钙离子信号通路等有关;与氧化应激及ROS产生相关的差异表达基因蛋白之间具有很好的相互作用,且PCR验证结果与RNA-Seq呈现极显著的相关性。3.NOX1对猪小肠上皮细胞(IPEC-1)氧化损伤和细胞自噬的影响运输应激导致生猪空肠组织中NOX1水平增加,而NOX1是ROS产生的关键酶,NOX1在IPEC-1细胞氧化损伤及细胞自噬中的作用尚待进一步阐明。本研究通过筛选NOX1抑制剂(ML171)最佳浓度,利用该浓度抑制剂和300μM H_2O_2共同处理IPEC-1细胞,收集细胞和上清培养液,检测细胞氧化损伤标志分子(MDA、SOD、LDH)的含量以及细胞ROS水平、线粒体膜电位水平及线粒体数量的变化;提取细胞RNA和蛋白质,通过QPCR和Western Blot检测细胞肠黏膜屏障紧密连接蛋白基因的表达、自噬相关蛋白分子以及SIRT1和PGC-1α基因和蛋白的表达水平。与H_2O_2处理组相比,NOX1抑制剂能够降低IPEC-1细胞MDA、LDH、ROS含量,上调SOD活力;抑制NOX1可恢复线粒体膜电位水平和线粒体数量,增加紧密连接蛋白Claudin-1、ZO-1的表达;抑制自噬相关蛋白的表达,增加SIRT1、PGC-1α表达。表明抑制NOX1表达能缓解H_2O_2造成的氧化应激,逆转H_2O_2诱导的细胞自噬水平,并参与了肠黏膜屏障氧化损伤修复。根据以上结果得出如下结论:1.运输能够导致生猪抗氧化水平降低,内毒素累积,引起肠道明显的氧化损伤,并激活细胞自噬和PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。2.RNA-Seq技术筛选共1036个肠道氧化损伤转录本差异基因,其中606个基因上调,430个基因下调,且差异表达基因与PI3K-Akt、氧化应激、ROS产生、细胞凋亡等信号通路相关。3.抑制NOX1表达可降低IPEC-1细胞ROS和细胞自噬水平,提高肠黏膜屏障紧密连接分子表达并增加SIRT1/PGC-1α通路活性,缓解H_2O_2诱导的IPEC-1细胞氧化损伤。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S828
【图文】：

NOX1诱导ROS产生(Gawdziketal2011)

华中农业大学 2019 届硕士研究生学位（毕业）论文中 ROS 含量和 NOX1 基因表达水平增加以及抗氧化物酶 CA，诱导 H9c2 细胞氧化应激，且自噬相关蛋白 LC3II 表达上ng et al 2012)。所以，在氧化应激状态产生过量 ROS 诱发的胞成分，调节细胞功能达到正常提供保护途径。

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本文编号：2715097