猪伪狂犬病病毒UL56蛋白与宿主相互作用WW-domain蛋白的筛选

发布时间：2020-06-15 23:13

【摘要】：伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一种猪烈性传染病。猪是其唯一自然宿主及主要传染源。感染后可导致妊娠母猪流产、产死胎及木乃伊胎,公猪不育和育肥猪呼吸系统症状。初生仔猪主要表现为神经系统症状,病死率高达100%,但目前还没有特效药物治疗,主要以疫苗预防为主。2011年以来,中国很多猪场相继发病,给养猪业造成了巨大的经济损失。研究表明我国流行的PRV毒株为基因II型变异株,Bartha-K61弱毒疫苗免疫不能对其起到防控作用。PRV UL56蛋白(pUL56)属于II型膜蛋白,研究发现pUL56可促进PRV在神经元之间的传播,且对病毒的毒力有一定的影响。本研究以pUL56为研究对象,筛选与其互作的含有WW结构域(domain)的宿主蛋白。通过免疫共沉淀(Co-immuoprecipiated,Co-IP)实验确定了与pUL56相互作用的WW-domain宿主蛋白:Bcl-2相关永生基因3(Bcl-2 associated athanogene 3,BAG3)蛋白、神经前体细胞表达发育下调蛋白4(Neural precursor cell expressed developmentally down regulated 4,Nedd4)和ITCH。利用激光共聚焦实验确定了表达带有绿色荧光蛋白(GFP)的GFP-pUL56与HA-mBAG3、HA-mNedd4及HA-sITCH在转染的HEK293T细胞高尔基体上存在共定位。通过互作,GFP-pUL56可将细胞质分布的HA-mBAG3、HA-mNedd4及HA-sITCH重新定位于高尔基体。前期研究已证实多种病毒蛋白可通过其编码的PPXY基序(PY motif)与含有WW-domain的宿主蛋白产生互作。为验证pUL56与宿主蛋白的互作是否通过PY motif发挥作用,本研究将pUL56截短表达为N末端、中间区域(包含全部PY motif)及C末端。分段Co-IP实验结果证明BAG3、Nedd4和ITCH主要与pUL56中间区域互作。此外,pUL56 C末端与Nedd4也存在互作。本研究将pUL56编码的4个PY motif突变为AAXY。Co-IP实验结果表明随着PY motif突变的增加,pUL56与宿主蛋白互作能力逐渐减弱,其中pUL56 PY motif全部突变后与BAG3和ITCH完全失去互作能力,而与Nedd4仍存在微弱的互作;激光共聚焦实验结果表明PY motif全部突变后,Nedd4和ITCH与pUL56在细胞内仅存在微弱的共定位信号。此外,pUL56可介导宿主蛋白BAG3、Nedd4和ITCH表达下调。其中,pUL56 PY motif在Nedd4及ITCH的下调过程中发挥作用,而对BAG3的下调无作用。因此,pUL56介导的BAG3下调存在其他分子机制。综上,本研究阐明了PRV pUL56与宿主蛋白BAG3、Nedd4及ITCH之间存在相互作用及其互作的分子机制。并且,pUL56可显著下调WW-domain宿主蛋白的表达,为揭示PRV pUL56的毒力表型奠定了分子基础。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.651
【图文】：

病毒粒子,图片,核衣壳

粒子结构疱疹病毒 1 型（Suid herpesvirus 1，SuHV-1），水痘病毒属成员，DNA 双链病毒，在进化上与 virus，HSV）高度同源，两者的病毒粒子结构极的 PRV 病毒粒子呈圆形或椭圆形，直径约 150～（如图 1.1）：由内而外依次为由缠绕成圆柱状的线；蛋白衣壳是由呈二十面体对称的壳粒组成，其毒的核衣壳；在核衣壳外有一层非晶体状蛋白样着连接核衣壳与病毒囊膜的桥梁作用；包围在病病毒囊膜，囊膜上镶嵌着病毒编码的 10 余种糖要作用[5, 8, 12, 13]。

序列,基因组,线性图,图片

图 1.2 PRV 基因组的线性图：基因组及转录体系（图片来自 Ashley E. Reynolds，2005） Linear map of the PRV genome: genome and transcript org（Figure adapted fromAshley E. Reynolds, 2005）部分衣壳蛋白是根据 HSV-1 的研究中推算出来或 VP5）由 UL19 编码成 162 个壳体（150 个六邻6 个二十面体晶格。UL19 的结构排列及序列在所码衣壳直径约为 125 nm[16]。每个六邻体由 6 个5（VP26）分子组成衣壳的边缘和表面，12 个五六邻体之间由 UL38（VP19C）、UL18（VP23）及接。其中 11 个五聚体是由 UL19（VP5）组成的 UL6 分子构成的独特的圆柱形通道[17]。每个成熟的子、900 个 UL35（VP26）分子、640 个 UL18 分（VP19）和 12 个 UL6 分子（蛋白通道），这个 DNA 基因组进入包装成预成型的衣壳[16]。

【参考文献】