重组玉米赤霉烯酮降解酶的表达

发布时间：2020-06-16 04:52

【摘要】：玉米赤霉烯酮(Zearalenone)是一种主要由镰刀菌产生的具有假雌激素作用的霉菌毒素,会对动物的生殖系统造成损伤,影响生育功能。玉米是重要的粮食及饲料来源,同时也是受到玉米赤霉烯酮污染的主要农作物,近年来玉米赤霉烯酮的污染范围和程度有扩大上升趋势,因此如何降解受污染农作物中玉米赤霉烯酮正成为亟需解决的安全和经济问题。本实验采用的生物方法是酶法降解,选用一种玉米赤霉烯酮内酯水解酶,该酶能够打开玉米赤霉烯酮分子中的内酯环,使得开环后的玉米赤霉烯酮不再能与雌激素受体结合,从而起到毒素降解的作用。本实验成功在毕赤酵母中表达了一段来源于粗糙脉孢菌的玉米赤霉烯酮内酯水解酶基因,该基因全长888 bp,表达产物含有296个氨基酸,具有三联催化位点,属丝氨酸蛋白酶家族。通过电转化成功将该基因转入毕赤酵母中,获得重组毕赤酵母,并对该酶进行了摇瓶发酵和30L发酵罐发酵。甲醇诱导72 h后,重组毕赤酵母的摇瓶产量为40 U/ml;在摇瓶发酵之后还进行了30L发酵罐发酵,在发酵90 h,亦即甲醇诱导72 h时发酵罐酶活达到最大,为290.6 U/ml,验证了该酶进行大规模发酵生产的可行性。将该酶纯化后检测了其酶学性质,该酶最适pH 8.0,最适温度45℃,对玉米赤霉烯酮的K_m值为38.63±5.868μM,V_(max)为23.8μM/s/mg,对浓度为5 mM的Zn~(2+)、Mg~(2+)和Ca~(2+)等离子具有较好的耐受性,对EDTA和SDS、Mn~(2+)的耐受性较差。当处于pH 6.0-8.0,37℃的环境条件时,酶活可以稳定存在1 h,24 h后酶活仍保持近一半。该酶在对10μg玉米赤霉烯酮纯品进行降解时,反应10 min可降解82%的玉米赤霉烯酮,反应15min则可降解99%的玉米赤霉烯酮,液质联用检测产物为无毒物质。实验还研究了该酶在常见饲料原料和发酵麸皮中的玉米赤霉烯酮降解效果。其在DDGS、玉米副产物及玉米皮中降解实验中的降解率分别可以达到70.9%、88.9%和94.7%;其在发酵麸皮中的降解率最高可达51%,且加入发酵菌粉比发酵菌液更有利于降解。此外还尝试了对该酶应用固定化技术,提升了该酶对pH和温度的耐受性并且可以多次循环使用。其中以活化CNBr琼脂糖珠和活化NH_2琼脂糖珠为载体的固定酶表现最佳,其在pH 5.0条件下相较于游离酶能够保持更多的酶活,分别为52.5%和56.2%;在60?C条件下的酶活分别为50.9%和32.4%。本实验对该酶进一步在实际生产中的应用有重要指导作用。
【学位授予单位】：齐鲁工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q814;S859.8
【图文】：

图 1-1 玉米赤霉烯酮结构式Fig.1-1 Chemical structural formula of Zearalen来源及分布由镰刀菌分泌产生，镰刀菌是小麦赤霉病到土壤中霉菌沾染和作物收获后在处理加受到玉米赤霉烯酮毒素的污染[23]。作物被便容易滋生霉菌，从而被霉菌毒素污染[24米则是最不易受霉菌毒素污染的作物[25]。类粮食作物均受到不同程度的玉米赤霉烯物中的玉米赤霉烯酮含量最高可达 1362μ均含量为 1700 μg/kg[27]；荷兰的玉米作利的玉米中玉米赤霉烯酮含量少，均不超过物包括大麦小麦和玉米等，它们中的玉米为 647μg/kg[33]，其余作物含量不超过 100

ENC 总共 196 个密码子根据毕赤酵母偏好性进行了密码子优化，优化量从 57.7 %降低至 44.81 %，密码子适应指数由 0.58 提升至 0.95。目的隆进 pPIC9K 质粒，并进行了酶切验证（图 2.1.a 和图 2.1.b）。使用 NCBINC 进行氨基酸序列分析，推断成熟的 ZENC 蛋白包含 296 个氨基酸残基源于 N. tetrasperma 的推测蛋白具有 97 %的同源性，与经过实验验证stachys rosea 的玉米赤霉烯酮水解酶（ZHD101）具有 29 %的同源性。对守结构域同源性分析结果还表明， ZENC 与来源于 日本慢orhizobiumjaponicum）的 2-乙酰氨基亚甲基琥珀酸水解酶（2-acetamidate hydrolase，NCBI 检索号：WP_010914326.1）具有 23 %的保守结构 与来源于慢生根瘤菌的 2-乙酰氨基亚甲基琥珀酸水解酶都具有 α/β 水解有相同的三联催化位点，该三联催化位点是丝氨酸水解酶家族的主要特亚甲基琥珀酸水解酶的催化位点已经被研究阐明，因此在保守域数据库氨基酸序列进行对比后发现，ZENC 具有 Ser117、Asp141和 His274三联断 ZENC 属于丝氨酸水解酶家族（图 2.1.c）。

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本文编号：2715558