牛源抗菌肽BSN-37体外的细胞毒性及抗沙门氏菌活性的研究

发布时间：2020-06-16 22:42

【摘要】：面对耐药甚至多重耐药细菌种类增加所造成的人类卫生健康和食品安全双重压力,寻找新型临床治疗替代药物已经成为当务之急。抗菌肽作为生物界普遍存在的先天免疫防御系统一部分,以广泛的来源,丰富的序列结构以及其表现出的抗细菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤和免疫调节等多样药用生物活性成为备受关注的焦点。本实验室前期研究工作中,在牛脾脏内分离到一个新抗菌肽BSN-37,内含37个氨基酸残基,富含脯氨酸和精氨酸,并经初步测定对大肠杆菌具有较低的MICs。本研究在前期试验的基础上通过BSN-37体外的生物活性试验、对沙门氏菌的作用机制和对沙门氏菌胞内增殖的影响能力,阐述抗菌肽BSN-37的生物活性,杀菌机制,并为开发抗菌肽BSN-37成为治疗沙门氏菌感染药物奠定理论基础。体外生物活性研究包括对系列模式菌株和临床分离耐药沙门氏菌MICs检测、盐离子抗性、杀菌动力学、溶血性和细胞毒性。结果发现,抗菌肽BSN-37对革兰氏阴性菌有良好的抑菌效果,对耐药菌也表现出与相应模式菌株相似MICs;除Ca~(2+)外主要生理浓度盐离子不影响BSN-37对沙门氏菌的抑菌活性;抗菌肽BSN-37作用呈现浓度时间依赖性;抗菌肽BSN-37表现出极低的溶血性,且对VERO、CEF、RAW264.7和IPEC-J2未表现细胞毒性。总之,抗菌肽BSN-37体外对沙门氏菌抑菌活性稳定,其活性受盐离子生理浓度浓度影响较小,体细胞无细胞毒性。其次,研究BSN-37对鼠伤寒沙门氏菌CVCC541菌膜通透性、细胞膜去极化并扫描电镜和透射电镜成像。在膜损伤显著的阳性对照抗菌肽Pexiganan对比下,试验发现,抗菌肽BSN-37对细菌菌膜的通透性影响和去极化能力均较弱,通过扫描电镜和透射电镜图像发现只有在高浓度或较长时间条件下抗菌肽BSN-37可以造成沙门氏菌菌膜损伤,同杀菌曲线结果保持一致,结果表明,抗菌肽BSN-37通过非膜损伤机制作用沙门氏菌。最后,研究BSN-37对MDCK胞内沙门氏菌增殖数量影响。结果表明,在沙门氏菌共侵入的16 h内,试验组在侵入2 h加入抗菌肽BSN-37后,未处理组的MDCK胞内鼠伤寒沙门氏菌CVCC541菌数量为处理组的1.99倍,临床分离耐药鼠伤寒沙门氏菌SB217表现为2.39倍。分析表明,抗菌肽BSN-37能够显著减少沙门氏菌在MDCK细胞内的增殖量。综上所述,抗菌肽BSN-37对革兰氏阴性菌有良好抑菌活性,无细胞毒性;对沙门氏菌除Ca~(2+)外其活性不受生理盐离子浓度影响,呈浓度时间依赖性,通过非模损伤机制作用沙门氏菌,并对细胞内沙门氏菌增殖产生影响。
【学位授予单位】：河南科技学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61
【图文】：

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图 1-1 抗菌肽四个经典二级结构模式[42]A：α-螺旋；B：β-折叠；C：无规则延伸；D：环状。Fig 1-1 Protein models representing the structural differences of the four classeantimicrobial peptides.5 抗菌肽的作用机制5.1 菌膜损伤机制研究者普遍认为抗菌肽的杀菌机制主要通过膜损伤表现。抗菌肽的结构特点同，如肽链的长短、二级结构、疏水位点及能力、两亲性、所带电荷数量和氨基酸此外，各种属间细菌菌膜结构、组成以及流动性各有差异，因此，膜损伤的机制不相同，在大量的科研探索中逐渐形成以下几种菌膜损伤模式假说。

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第一章文献综述类机制，。如 MccJ25 除作用核酸外，还能抑制琥珀脱氢酶和 NADH 脱细胞能量代谢[54]。部分富含脯氨酸抗菌肽与大肠杆菌的热休克蛋白DnaK组 DnaK 的 ATP 酶活性，抑制伴侣辅助蛋白折叠生成功能构象，而同样菌肽的 drosocin 却使 DnaK 失活[56]，在作用同一功能蛋白是表现出两种肽PR-39降解复制DNA相关蛋白影响DNA合成[57]。人源富含组氨酸的的在细菌线粒体内聚集，破坏 ATP 酶活性，诱导白色念珠菌氧化应激碍[58]。

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