类泛素化活化酶NAE对流感病毒增殖的影响及NEDD8单克隆抗体的制备

发布时间：2020-06-17 04:32

【摘要】：Neddylation修饰是体内一种广泛的翻译后修饰作用,通过NEDD8类泛素蛋白小分子与底物蛋白的结合而实现这种修饰作用。该修饰作用广泛地参与细胞内的多种调控,如信号转导、DNA损伤、细胞增殖与分化、细胞周期、细胞凋亡、蛋白质转运等过程。最近研究发现,流感病毒蛋白PB2能被Neddylation修饰而导致PB2蛋白的稳定性降低,从而抑制了流感病毒的复制。可见在流感病毒感染过程中,体内的Neddylation修饰起到了一种抗病毒作用。本研究通过构建Neddylation通路关键酶——NEDD8活化酶(E1)的Knock down(KD)细胞系,并用流感病毒(PR8)感染,以探究流感病毒在KD细胞系中的增殖情况,为更好地阐述流感病毒与Neddylation通路之间的关系提供了依据。同时我们也制备了类泛素小分子蛋白NEDD8的单克隆抗体,这为今后更深入地研究内源性Neddylation修饰作用打下了良好的基础,为更好的阐述在病毒感染中Neddylation的免疫调控作用提供了实用的生物工具。本论文的主要研究结果如下:1.流感病毒在Knock down(KD)细胞系中的增殖效率升高将含有NAE1、UBA3靶序列的shRNA质粒以及Δ8.9、VSVG辅助质粒共转染293T细胞进行慢病毒包装。将包装出来的慢病毒感染A549细胞,感染24h或48h后在培养基中加入嘌呤霉素,筛选出已被慢病毒感染的细胞,经扩大培养获得相应的KD细胞系,分别命名为NAE1-KD、UBA3-KD。用流感病毒(PR8,1MOI)感染获得的KD细胞系以及对应的对照组细胞系,感作2h后,弃上清并用无菌PBS洗去未结合的流感病毒,加入新鲜的培养基。在不同的时间点(6h、12h、24h、30h)收取细胞及细胞上清,每个时间点两个重复。通过Western blot、TCID_(50)检测和实时荧光定量PCR检测发现,在KD细胞系中各个时间点,无论是病毒蛋白(NP、NS1)的表达水平,还是病毒蛋白的mRNA转录水平,或者是成熟病毒粒子滴度(TCID_(50))都较对照组细胞有明显上升,而且在NAE1-KD细胞系中,这种上升趋势更加明显。因此,细胞中E1的表达水平降低之后,能够促进流感病毒的复制。2.类泛素小分子蛋白NEDD8单克隆抗体的制备利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从A549细胞中扩增出类泛素化蛋白编码的NEDD8基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,测序验证后转化入BL21(DE3)进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,表达获得NEDD8蛋白,经纯化后,免疫接种6周龄BALB/c小鼠。细胞融合后,用酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹(WB)方法筛选单克隆抗体细胞株。结果成功制备获得3株单克隆抗体,分别命名为:4B7、1G11、1G3。免疫特异性鉴定结果表明:3株单克隆抗体都有良好的WB及ELISA效价。其中所得到的1G11株单抗适用于免疫共沉淀试验,可以特异性检测NEDD8修饰的Cullin-1底物。通过分段表达,鉴定单抗针对的抗原表位可能在~(29)RVEE~(32)氨基酸区域,与泛素化蛋白(Ub)无交叉反应。本研究制备的特异性单抗为进一步鉴定NEDDylation修饰底物提供了良好的抗体工具。综上所述,本研究初步揭示了NEDDylation修饰过程中的活化酶NAE对流感病毒增值的抑制作用,且成功制备了类泛素化蛋白NEDD8的单克隆抗体,为深入研究流感病毒分子致病的免疫调控机制奠定了良好的基础。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

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NAE 对流感病毒增殖的影响及 NEDD8 单克隆抗体的制备图1-1 流感病毒粒子模式图（Gunilla B et al.2008）Figure1-1 Schematic diagram of influenza A virvs（Gunilla B et al.2008）考虑到 IAV 对人类和动物健康的巨大威胁，通过世界组织如世界动物卫生组织（OIE），联合国粮食及农业组织（FAO）和以“唯一健康”为宗旨的世界健康组织的全球合作对这些病毒进行监测和控制(Anderson, Capua et al. 2010, Pfeiffer, Otte et al. 2013,Short, Richard et al. 2015)。接种疫苗被认为是控制和预防人和动物的 IAV 感染的最有效途径。但是，尤其对于工业环境中的家畜（例如，快速更新和高密度放养）而言，需要谨慎使用 IAV 疫苗，必须对疫苗的生物安全性进行高水平的控制并对其进行定期监测，以防止其加速病毒进化。尽管灭活疫苗在全世界范围内一直用于人类和动物医学，但采用最新技术的新一代 IAV 疫苗正在开发和商业化。1.1.1 人类中的季节性、大流行性和人畜共患流感病毒人类流感感染可分为季节性，大流行性和人畜共患病。季节性流感是由甲型，乙型和丙型流感病毒引起的，约占全球每年约 300 万至 500 万例严重疾病和约 25 万至 50 万人死亡。据估计

示意图,甲型流感病毒,示意图,特异性转录因子

?流感病毒先天性免疫及 Neddylation 通路研究进展 7图1-2 甲型流感病毒（IAV）感染的先天性免疫应答示意图（Chen et al.2017）Figure1-2 Schematic diagram for innate immune response against influenza A virus(IAV) infection（Chen etal.2017）1.2.3 抗病毒分子参与先天免疫对抗 IAV 感染在 IAV 感染期间，NF-êB，IRF3 和 IRF7 特异性转录因子被激活而易位至细胞核，在核中启动编码 IFNs 和促炎细胞因子（TNF，IL6，IL1β等）基因的转录。众所周知，I 型 IFNs 如 IFN-α和 IFN-β以及 III 型 IFNs（IFN-λ1，IFN-λ2

【参考文献】