表达寨卡病毒E、ME蛋白DNA疫苗构建及新型佐剂筛选研究

发布时间：2020-06-17 12:53

【摘要】：寨卡(ZIKA)由寨卡病毒(ZIKA virus,ZIKV)感染引起的,是21世纪最具破坏性的传染性疾病威胁之一。ZIKV作为一种新兴蚊媒传播病毒,2007年以前主要表现为散发型,2007年在密克罗西亚的雅浦岛引起了重大疫情。自2015年该病毒传染至巴西以来,病毒迅速蔓延至南美洲、拉丁美洲、非洲、东南亚、太平岛等地区。ZIKV感染可引起神经系统疾病,包括小头畸形和格林-巴利综合征,截止2017年世卫组织报告了84个具有寨卡病毒传播的国家或地区,急需开发安全有效的寨卡疫苗。DNA疫苗又称基因疫苗或核酸疫苗,使外源基因在活体内表达,产生的抗原激活机体的免疫系统,从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。与传统疫苗相比基因疫苗具有一些优越性:质粒DNA非常稳定,使用方便,应用较安全;制备简单,容易大量生产,成本低,易于贮存和运输;能够产生持久的免疫应答,免疫保护力增强;可以插入不同的保护性抗原基因,构成多价或多联疫苗等。佐剂是与抗原或与抗原混合注入机体后,能够增强机体对抗原的免疫应答或者改变免疫反应的类型,属于非特异性的免疫增强剂,而其本身无抗原性。本实验以BALB/c小鼠为实验模型,选用了6种佐剂,将其中2种具有递送功能的刺激物与其余4种成份组合成不同佐剂配方。然后与构建的表达载体DNA疫苗联合免疫小鼠,同时设立对照组,分析其免疫效果。本研究以pVAX1为载体表达ZIKV E、ME保护性抗原为候选疫苗,并进行小鼠免疫原性分析。根据GenBank上已公布的ZIKA基因序列合成ME基因(KU365780)。PCR扩增E、ME蛋白基因,经比对测序结果正确后,连接到pVAX1载体上,构建表达目的蛋白的DNA疫苗。将重组质粒转染至HEK293细胞,采用Western blot检测目的蛋白的表达。结果显示所构建的DNA疫苗在56及68kDa成功表达了E、ME蛋白。本实验通过小鼠免疫实验,分析不同佐剂组合对DNA候选疫苗免疫原性的影响,T细胞亚群检测表明疫苗免疫组,CD3~+CD4~+T、CD3~+CD8~+T淋巴细胞亚型数量高于PBS组;T淋巴细胞增殖实验结果表明含佐剂疫苗免疫组显著高于PBS对照组(P0.05);ELISA抗体检测结果显示疫苗组能够诱导机体产生较高于PBS对照组的特异性抗体水平;细胞因子检测显示含佐剂组的IL-4及IFN-γ含量显著高于不含佐剂疫苗组(p0.05)。说明所构建的DNA疫苗能够诱导机体产生体液免疫和细胞免疫,并且初步筛选出两组对ZikaE、ZikaME的DNA候选疫苗有显著提高作用的新型疫苗佐剂,为寨卡疫苗佐剂的选择提供基础。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.4
【图文】：

示意图,基因组结构,示意图

还可以通过性接触直接在人与人之间传播，也可从母亲垂直传播到胎儿。迄今为止，与其他新出现的虫媒病毒相比如黄热病，登革热（DENV），西尼罗河（WNV），流行性乙型脑炎（JEV）和基孔肯雅病毒（CHIKV），ZIKV 感染的生物学仍然知之甚少[7]。1.1 ZIKV 基因组学黄病毒属的特征，ZIKV 具有 11kb 的正链 RNA 基因组，其由单个开放阅读框组成，长度为 10794bp，其侧翼为 5'和 3'非翻译区（UTR）[8]。ORF 编码 3423个氨基酸（aa）的单个大的多蛋白，随后在宿主和病毒蛋白酶翻译后被切割成三个结构蛋白，包膜 E（~500 aa），膜前体 prM（~168 aa）和衣壳 C（~122 aa），这三种结构蛋白是形成感染性病毒粒子所必需的。以及七种非结构蛋白 NS1（~352aa），NS2A（~226 aa），NS2B（~130 aa），NS3（~617aa），NS4A（~152 aa），NS4B（~251 aa）和 NS5（~903aa），是病毒复制和组装所必需的[9]，结构示意图见图 1.1。

颗粒图,蛋白结构,蛋白

和受体相互作用然后病毒包膜和细胞内膜之间的融合过程允许黄病毒进入靶细胞。晶体结构显示 E 蛋白含有独特的带正电荷的贴片，可能影响宿主的附着。ZIKV E 蛋白具有 “人字形”特征性的结构，单体 E 由三个不同的结构域组成：DI，DII 和 DIII。指状 DII 含有融合环（FL），其在 pH 依赖性构象变化期间内体膜驱动融合，插入宿主细[11]。E 蛋白单糖基化位点（Asn154），位于 E 残基与邻近的 E 蛋白融合肽相邻的环上，可以控制溶剂进入融合循环。此外，E 蛋白也是通过识别 ZIKV E 蛋白融合环区域抗体的主要靶标。E 蛋白在寨卡病毒入侵细胞起至关重要的作用，是参与受体结合和融合的主要蛋白质，在病毒颗粒表面形成头对尾二聚体。并能诱导机体免疫应答，该蛋白被看成是亚单位疫苗或重组疫苗的首选目的蛋白[12]。M 蛋白（~75aa）或 prM 蛋白（~165aa），M 蛋白是一种隐藏在 E 蛋白层下的小蛋白质。M 蛋白由含一个螺旋的茎、两个螺旋的跨膜区及 N 端的 M 环形成。prM 参与膜蛋白折叠，可防止与宿主膜过早融合，被切割成 M 蛋白及 pr 肽。表面蛋白质以二十面体状对称排列，由 60 个重复的 E 和 M 蛋白单元组成，病毒颗粒由脂质包膜包围二十面体衣壳组成，直径为 40-70nm[13]（图 1.2）。

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