神经细胞eIF3i对VSV复制的影响及其机制的研究

发布时间：2020-06-17 21:30

【摘要】：水疱性口炎(Vesicular stomatitis)是由水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)感染引起牛、马、猪等多种动物和人的一种人兽共患传染病。尽管目前我国还没有VSV感染病例的报道,但国内学者对云南省蝙蝠携带病毒的病原生态学研究发现,蝙蝠是VSV的携带者,提示该病的发生具有潜在风险。最近几年来,羊小反刍兽疫和非洲猪瘟这两个外来病陆续传入我国,给畜牧业造成巨大的经济损失,水疱性口炎作为危害性较大的外来病也应该引起大家的高度关注!因此,积极开展VSV相关的基础研究工作对于该病的防控具有重要的科学意义。同时,VSV具有广泛的细胞嗜性,使其成为用于病毒与宿主间相互作用、病毒疫苗载体等多方面研究的一个较为理想的模式病毒,并且在相关领域取得了较多的研究进展。尽管VSV作为病毒载体已得到了广泛的研究和应用,但作为一种活病毒载体,很多研究人员认为其具有潜在的生物安全风险,尤其VSV对中枢神经系统(CNS)的侵嗜性成为临床上VSV载体应用的最大障碍。此外,前期工作中,利用酵母双杂交技术、GST-pull down以及激光共聚焦实验等证实VSV基质蛋白(M)能与宿主细胞翻译起始因子eIF3i相互作用,但VSV在神经细胞复制过程中,eIF3i发挥怎样的调控作用并不清楚。首先,细胞凋亡与病毒的复制增殖密切相关,本研究通过在荧光显微镜下观察发现,VSV感染鼠神经瘤母细胞(Neuro-2a,N2a)12 h或24 h后,感染细胞细胞核碎裂,染色质致密浓染,并增强蓝色荧光。同时,利用流式细胞技术检测VSV感染N2a细胞过程中细胞凋亡的情况,结果显示,VSV感染N2a细胞8 h后,与对照组相比,VSV感染细胞凋亡率显著升高,表明VSV可诱导神经细胞凋亡。而利用Western blotting检测VSV感染N2a细胞不同时间点,Akt蛋白激酶活化及其下游关键促凋亡蛋白Bax表达情况,结果显示,VSV可以抑制Akt磷酸化(p-Akt)并且促进Bax表达,表明VSV可经Akt/Bax信号通路诱导N2a细胞凋亡。其次,为了明确VSV感染对eIF3i表达的影响,本研究利用qRT-PCR和Western blotting方法,分别从基因和蛋白水平研究eIF3i在VSV感染神经细胞过程中的表达;结果发现,VSV(MOI=10)感染N2a细胞4 h或8 h后,VSV促进eIF3i蛋白表达,但是在VSV感染12 h后,VSV抑制eIF3i蛋白表达;表明VSV感染神经细胞过程中,早期VSV感染促进eIF3i的表达,而后期VSV感染抑制eIF3i的表达。再者,本研究设计、合成针对eIF3i的siRNA或构建eIF3i过表达载体,转染N2a细胞后接种VSV,通过Western blotting、荧光定量PCR、以及TCID_(50)等方法检测病毒的含量,结果发现干扰eIF3i的表达促进VSV的复制,而过表达eIF3i抑制VSV的复制。为进一步研究神经细胞eIF3i对VSV复制的作用机制,本研究利用Western blotting检测VSV感染N2a细胞后Akt的激活情况,发现过表达eIF3i可以促进p-Akt表达上调,而干扰eIF3i显著抑制p-Akt的表达。其次,利用Akt特异性激活剂SC79激活N2a细胞Akt信号通路,再接种病毒,发现Akt被激活后,VSV复制显著受到抑制。上述结果证明神经细胞eIF3i的表达与Akt的激活密切相关,并且eIF3i可促进Akt的磷酸化,调控细胞凋亡抑制VSV的复制。再者,VSV感染干扰或过表达eIF3i的神经细胞后,qRT-PCR检测Irf3、Irf7、IFNβ基因表达情况,发现干扰eIF3i后,干扰素相关基因表达水平显著下调;而过表达eIF3i后,干扰素相关基因表达水平显著上调。上述结果表明,神经细胞eIF3i可通过促进Akt的激活,调控细胞凋亡干扰病毒粒子的释放,以及eIF3i可同时促进干扰素相关基因的表达,启动抗病毒反应来抑制VSV复制增殖。综上所述,VSV感染神经细胞通过与eIF3i相互作用并影响其表达,经Akt途径调控细胞凋亡并影响抗病毒反应来调控VSV的复制增殖。该研究成果不仅揭示神经细胞eIF3i在VSV复制过程中的作用,而且可能为在中枢神经系统中抗VSV的防治研究提供理论基础。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65
【图文】：

图 1.1 Hoechst 33258 染色观察 (标尺：400 μM)Figure 1.1 The Observation of N2a cell staining Hoechst 33258（Scale bars：400 μM）A:正常组 B:VSV 感染 12 h C: VSV 感染 24 hA: The normal group B: N2a cell infected VSV after 12 h C: N2a cell infected VSV after 24 h1.3.2 VSV 感染神经细胞凋亡率的检测应用 Annexin-V FITC/PI 双标试剂盒对 VSV 感染的 N2a 细胞进行标记，通过流式细胞仪检测不同时间段 VSV 感染 N2a 细胞的凋亡率，如图所示，在双变量散点图上，Q1 表示死细胞，Q2 表示中晚期凋亡细胞，Q3 表示活细胞，Q4 表示早期凋亡细胞， Q2 和 Q4 细胞占全部细胞的百分比代表细胞的凋亡率（图1.2A）。结果表明，VSV 感染 N2a 8 h，12 h 后，与对照组相比，细胞凋亡率显著上升（图 1.2B），证明 VSV 可以诱导神经细胞 N2a 发生凋亡。

图 1.2 VSV 感染神经细胞凋亡率的检测ure 1.2 The detection of apoptosis rate of N2a cells infected with VSV散点图分析柱状图variate scatter plot B：Histogram of apoptosis rate analysisSV 对神经细胞 Akt 激酶的影响及其相关信号通路与细胞凋亡密切相关。本研究利用 Western blotti酶磷酸化水平。实验结果采用 Prism 软件中的独立样本 T 检验进行作成柱状图。结果表明 VSV 感染 N2a 后 2 h、4 h、6 h、8 h 后 显著下调（图 1.3A,B），表明 VSV 感染抑制 Akt 激酶活性，进而关通路。

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本文编号：2718192