基于分子佐剂的禽腺病毒亚单位疫苗研究

发布时间：2020-06-19 06:03

【摘要】：禽腺病毒引起的包涵体肝炎和心包积水综合征给我国的禽类养殖业造成了巨大损失。病毒感染前期,禽无明显临床症状,无法进行早期治疗,因此疫苗接种成为首选的免疫防治策略。本文旨在研制一种高效、安全的亚单位疫苗,以应对禽腺病毒引起的感染。根据禽腺病毒的病原学研究,将抗原蛋白锁定为衣壳五邻体蛋白上的Fiber-2蛋白。为了使抗原发挥更强的免疫效力,挑选了细胞因子IL-2和IFN-γ做为疫苗佐剂,联合免疫后评价疫苗效力。首先,在昆虫细胞-杆状病毒系统中进行了Fiber-2的表达。将密码子优化后的Fiber-2序列插入至杆状病毒载体Bacmid上,将重组质粒转入Sf9细胞中,制备高滴度的病毒用于重组蛋白表达。使用双向琼脂扩散法对重组蛋白进行免疫原性检测,结果显示重组蛋白效价达到了 1:128,表现出良好的免疫原性。其次,在大肠杆菌系统中对细胞因子IL-2和IFN-γ进行表达。将密码子优化过的序列插入至pET28a(+)表达载体中,各种温度下的表达测试均显示目的蛋白以包涵体的形式存在于细胞裂解沉淀中,之后对两种蛋白包涵体复性。复性结果显示,重组chIL-2和chIFN-γ蛋白以可溶形式存在于缓冲液中。最后,我们将重组Fiber-2抗原和重组chIL-2、chIFN-γ分子佐剂制备疫苗免疫鸡群进行动物实验。单独Fiber-2的免疫保护结果表明,50 μg呢的剂量可为鸡群提供100%的保护效果。低剂量(10μg)Fiber-2蛋白与分子佐剂的联合免疫结果表明,chIFN-γ的佐剂效果优于chIL-2,两者同时与低剂量Fiber-2蛋白联合免疫对鸡群的保护率同样可达100%。
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.4
【图文】：

图１．１禽腺病毒Ｉ群的结构逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＦＡｄＶ－Ｉ．逡逑为３６邋ｋｂ线性双链ＤＮＡ，衣壳蛋白由六邻体、是Ｉ群禽腺病毒分型的依据；五邻体上的纤突蛋定位点，负责体外血细胞凝集［７］。逡逑会在禽体内复制但不引发疾病，大部分情况仅混合感染后，会加剧禽腺病毒的发病情况，影中真菌毒素污染的情况高于全球的平均水平，物中滋生大量曲霉。长期暴露在亚临床水平的，使其对传染性疾病更加敏感［８］。黄曲霉素与Ｆ积水症状。另外，混合感染会导致更严重的粘的死亡率［９］。逡逑

图２．１邋Ｓｆ９细胞生长曲线逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋Ｓｆ９邋ｃｅｌｌｓ．逡逑的摇瓶培养：细胞传代前进行细胞计数，接种密度为３￣５ｘｌ0５ｃ培养时装液量占总体积的１／５左右，预留足够的氧气，将摇瓶上培养２？３天后，取样，使用台盼蓝染色镜检计数密度及存为２４？３０邋ｈ，根据细胞密度数据与存活率判断细胞的健康程度，例如以５ｘｌ0５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ的密度接种，３天后细胞计数，密度为４ｘｌ以上，则可进行下一次传代。逡逑冻存于液氮中保种。冻存培养基的配方为：８０％无血清培养基、％邋ＤＭＳＯ。冻存程序为：逡逑前２？８°Ｃ预冷冻存所需培养基；逡逑摇瓶中细胞状态（活力及密度），将培养液转移至１５或５０邋ｍｌ无菌心５邋ｍｉｎ获取细胞沉淀；逡逑７

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本文编号：2720406