抗A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的研制与不同试剂盒临床检测差异性分析

发布时间：2020-06-20 07:28

【摘要】：禽白血病病毒(Avianleukosisvirus,ALV)属于反转录病毒科禽C型反转录病毒属,与禽类多种肿瘤性疾病及生产性能息息相关。该病毒主要引起禽类产生肿瘤以及慢性消耗性死亡,造成免疫抑制及生长迟缓,产蛋率大幅度下降,给养禽业带来巨大损失。ALV通过垂直和水平两种方式传播,限制本病的主要方法是淘汰阳性鸡,净化种群中的ALV-A、B、C、D、J和K等亚群。不同亚群病毒有不同的生物学特性以及临床症状,临床上选择合适的试剂盒是净化该病毒的关键。本研究通过研制针对A亚群禽白血病病毒gp85的单克隆抗体,并分析不同试剂盒检测禽白血病的差异性,为生产实践中禽白血病的净化提供研究基础。1 抗A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的制备与鉴定Gp85是ALV的囊膜蛋白,由ALV基因组中env基因编码,具有亚群特异性。本研究首先设计出一对针对A亚群禽白血病病毒env基因的特异性引物,PCR扩增本实验室分离保存的ALV-A-AH10毒株的gp85基因,然后构建原核表达载体PET32a-AH10-gp85,通过转化入BL21感受态细胞,筛选阳性转化质粒并经IPTG诱导表达,对表达的菌体进行超声波破碎,取离心后的上清和沉淀分别作SDS-PAGE分析,结果获得大小约53KD的目的蛋白。纯化后的PET32a-AH10-gp85蛋白与适量佐剂乳化后免疫6-8周龄BALB/c雌性小鼠,三次免疫后测小鼠血清抗体效价,对免疫效果较好的加强免疫,三天后取脾脏与骨髓瘤细胞进行融合。用感染AH10病毒的DF1细胞板,固定后,对融合成功的杂交瘤细胞进行IFA筛选。阳性孔经过2-3次亚克隆,结果获得五株稳定分泌单克隆抗体,分别命名为ALV-A-1B12、ALV-A-1C12、ALV-A-1E5、ALV-A-1F8 和 ALV-A-3D11。Western-blot 和 IFA试验结果表明,所获单抗3D11只针对ALV-A/B囊膜蛋白gp85抗原,而其余四株可与J亚群病毒发生荧光反应。本次研究成功制备出一株针对ALV-A/B的单克隆抗体(3D11),为快速筛检田间感染A/B亚群禽白血病病毒的鸡群提供了临床诊断试剂。2不同试剂盒检测禽白血病肛拭阳性率的差异性分析建立快捷准确,成本低,可用于大批量田间试验的诊断技术是防制禽白血病的重要一环。ELISA检测方法因其具有灵敏、快捷、适用于大面积检测等特点,在众多方法中脱颖而出,被广泛应用于禽白血病的种群净化中。为探索不同ELISA试剂盒针对禽白血病p27抗原检测灵敏度的差异性,本研究将60只2周龄黄羽雏鸡(包括30只活鸡、30只死鸡)进行编号并采集肛拭、血样及组织样本。分别用IDEXX公司p27抗原检测试剂盒和sELISA试剂盒检测其肛拭样本。血样及组织样本接种DF1细胞分离病毒,7天后取培养上清进行p27抗原检测及鉴定,分析比较肛拭阳性率差异,并通过PCR、RT-PCR及间接免疫荧光法验证。结果显示,sELISA试剂盒肛拭阳性检出率为68%,IDEXX试剂盒阳性检出率为27%,且IDEXX公司阳性检出样本均存在于sELISA试剂盒阳性检出的样本中。阳性差异样本通过测序分析,进一步确认为感染K亚群禽白血病病毒,这一结果显示,sELISA试剂盒能够更灵敏有效地检测阳性肛拭样本,特别是检测肛拭中的禽白血病K亚群病毒。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65
【图文】：

载体,材料

图１－１邋ＰＥＴ３２ａ－ｃ邋（邋＋邋）载体结构逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋ＰＥＴ３２ａ－ｃ邋（＋）邋ｃａｒｒｉｅｒ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ逡逑

重组质粒,基因,条带,后连接

３．１目的基因的扩增逡逑利用设计的特异性引物进行ＰＣＲ扩增ＡＨ１０－ｇｐ８５基因，经过１％琼脂糖凝胶电泳，得逡逑到一条１０１７ｂｐ大小的清晰条带（图１－１），与预期ＤＮＡ片段大小相符。逡逑Ｍ邋１逡逑ｌｋｂ邋—？邋＾—邋１０１７ｂｐ逡逑图１－１目的基因的扩增逡逑Ｍ：邋１邋ｋｂ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ逡逑ｌ：ＡＨ１０－ｇｐ８５基因ＰＣＲ扩增结果逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｇｅｎｅ逡逑Ｍ：邋ｌｋｂ邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ逡逑１：ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＨ１０－ｇｐ８５邋ｇｅｎｅ逡逑３．２重组质粒ＰＥＴ３２ａ－ＡＨ１０－ｇｐ８５的双酶切鉴定逡逑测序正确的ｐＧＥＭ－Ｔ－ｇｐ８５与表达载体质粒ＰＥＴ－３２ａ分别用ＢａｍＨＩ和Ｋｐｎｌ双酶切处理逡逑后连接，转化感受态细胞ＢＬ２１，利用试剂盒提取重组质粒，再通过ＢａｍＨＩ和Ｋｐｎｌ进行逡逑双酶切鉴定，可以看到酶切产物出现一条大小为１０１７ｂｐ的目的条带和一条大小约５９００ｂｐ逡逑

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