原花青素对棕榈酸致牛子宫内膜细胞氧化损伤的保护作用研究

发布时间：2020-06-20 09:01

【摘要】：[目的]酮病奶牛血液里游离脂肪酸(NEFA)显著增加,而棕榈酸(PA)是NEFA的主要成分。此试验旨在通过体外培养牛子宫内膜细胞(BEND),检测PA诱导BEND细胞的氧化损伤并探究原花青素(PC)作为抗氧化剂对Nrf2/ARE通路的影响及协助BEND细胞抵抗PA引发的氧化损伤作用机制,为进一步深入研究酮病以及PA和PC对奶牛生殖机能的作用机制奠定基础。[方法]通过添加PA和PC在6h,12h,24h,48h等不同时间点分别进行单独及联合培养BEND细胞,并运用CCK-8法检测BEND细胞的活力,之后分别采取其各自的试剂盒对过氧化氢酶(CAT),还原性谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX),丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD)和总抗氧化能力(T-AOC)等氧化指标进行检测,最后采用荧光定量PCR及Western-blot检测与细胞核有关的因子(Nrf2)及Nrf2/ARE通路调控其下游血红素氧合酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)、谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)、以及超氧化物歧化酶(SOD)的mRNA及蛋白表达量,探究PC对PA诱导BEND细胞氧化损伤的防护机制。[结果]1.通过CCK-8法检测发现:当PA的浓度在100-300μmol/L时,BEND细胞的活力变化不显著(P0.05),当PA的浓度为400μmol/L时,BEND细胞的活力显著下降(P0.05),当PA的浓度高于600μmol/L,BEND细胞的活力下降的极其显著(P0.01);当PC的浓度不足10μmol/L时,对BEND细胞起到保护的作用,一旦其高于10μmol/L后,BEND细胞就会受到抑制,并且随着浓度的升高,影响就更加明显;当PA、PC联合作用于BEND细胞时,PC能够拮抗PA诱导的氧化损伤。并在不同时间点加药后发现24h的作用结果最佳。2.通过对CAT,GSH,GSH-PX,MDA,SOD和T-AOC等氧化指标的检测得出:相较于空白组,PA组BEND细胞的CAT活力明显下降(P0.05);GSH含量,GSH-PX,SOD,T-AOC活力显著降低(P0.01),MDA含量显著升高(P0.01);PC组BEND细胞的CAT,SOD,T-AOC活力显著升高(P0.05);GSH含量,GSH-PX,活力显著升高(P0.01),MDA含量显著降低(P0.05);PA+PC联合组对比于其对应PA组,CAT活力略微提升,T-AOC活力得到提高(P0.05),GSH含量以及GSH-PX,SOD活力极显著升高(P0.01);MDA含量下降明显(P0.05),表明PC能够拮抗PA诱导BEND产生的细胞损伤。3.通过荧光定量PCR测定BEND细胞的mRNA表明与空白组相比,PA组的Nrf2、GCLC基因的mRNA表达量有所升高,但效果不显著;NQO1基因的mRNA表达量显著升高(P0.05);HO-1基因的mRNA表达量极显著升高(P0.01);而SOD基因的mRNA表达量略微降低。PC组Nrf2和SOD基因的mRNA表达量显著升高(P0.05),GCLC,NQO1和HO-1基因的mRNA表达量极显著升高(P0.01)。PA与PC联合组相较于PA组而言,Nrf2、GCLC的mRNA表达量有所提升但效果不明显,NQO1,HO-1和SOD基因的mRNA表达量显著升高(P0.05)。4.通过Western blot对BEND蛋白的产量检测发现,除了NQO1的PC与空白组相比其含量显著上升(P0.05)外,剩余各组只呈现升高和减少的态势。SOD的PA组与空白组相其含量略微下降外,剩下的Nrf2,GCLC,HO-1,NQO1基因无论PA组,PC组还是PA+PC联合组与空白组相比其蛋白表达量均呈现上升趋势。[结论]棕榈酸能够诱导BEND细胞产生氧化损伤,原花青素可以激活Nrf2/ARE通路调控其靶基因,拮抗棕榈酸诱发的氧化损伤,达到防护效果。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.23
【图文】：

细胞氧化,原花青素,棕榈酸,生长情况

第二章原花青素对棕榈酸致 BEND 细胞氧化指标的影响2.2 试验结果2.2.1 BEND 细胞不同时间点的生长情况如下图 1-6 分别为 BEND 细胞传代前以及传代后 0h，6h，12h，24h，48h的细胞生长状况。从图中可以看出细胞传代后 0-12h 细胞的贴壁量较少，24h 时可达到 80%-90%的贴壁量，48h 时基本贴满。

细胞氧化,原花青素,棕榈酸,生长情况

【参考文献】