输卵管特异性表达γ-IFN的转基因鸡初探

发布时间：2020-06-20 21:39

【摘要】：目的:随着转基因技术的不断进步,转基因动物的研究也不断取得新的进展。目前使用常规的转基因生物(如细菌、昆虫等)生产糖基化药用蛋白的生产能力受到很大的限制,利用转基因动物生物反应器生产糖基化药用蛋白的研究逐渐成为研究热点。转基因鸡输卵管生物反应器具有世代周期短、饲养成本低、繁殖快和产量高的优点,使其成为生产药用蛋白的理想选择。输卵管特异性表达的目的蛋白最终在鸡蛋蛋清中表达,而且蛋清中卵清蛋白含量高、组分比较简单,有利于目的蛋白的分离与纯化。以上诸多优点使鸡输卵管生物反应器在生物制药领域拥有良好的应用前景。本研究的目的是通过PiggyBac转座子载体介导的方法将γ-hIFN目的基因整合到鸡的基因组中,最终获得输卵管特异性表达γ-hIFN的转基因鸡。方法:(1)本研究首先根据前人的研究经验,结合本实验室的条件对鸡胚换壳培养体系进行了探索,建立稳定的鸡胚换壳培养操作流程,并对鸡胚盘下腔注射体内感染复合物的注射量进行对比实验,寻找最佳的注射量;(2)利用实验室己构建的pLenti6.4-cERE/cOVP-EGFP和pLenti6.4-CMV-EGFP载体分别转染HEK 293T细胞和原代鸡输卵管上皮细胞验证cERE/cOVP启动子的活性;(3)以实验室保存的pLenti6.4-CMV-γ-hIFN、pLenti6.4-cERE/cOVP-EGFP和PUC57-P2A-RFP载体为模板,分别扩增cERE/cOVP、y-hIFN片段和P2A-RFP片段,通过重叠PCR将γ-hIFN片段和P2A-RFP片段连接起来构建表达盒。然后将cERE/cOVP和γ-hIFN-P2A-RFP片段分别亚克隆至无启动子的PB002G转座子载体Nhel/Mfel和AscI酶切位点之间,构建特异性表达载体PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP,并将γ-hIFN-P2A-RFP表达盒克隆至PB-dual-promotor转座子载体的Mfel与Nhel酶切位点之间构建PB-dual-CMV-γ-hIFN-P2A-RFP表达载体,将PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP 和 PB-dual-CMV-γ-hIFN-P2A-RFP分别转染HEK 293T细胞和原代鸡输卵管上皮细胞,检测γ-hIF N和RFP表达。(4)利用in-vivo jetPEI转染试剂,将PB002G-cER E/cOVP-y-hIFN-P2A-RFP和PBase转座酶质粒进行X期鸡胚胚盘下腔注射,孵化到第14天取鸡胚组织器官提取基因组DNA,PCR检测目的基因在鸡胚的基因组中的整合情况。结果:(1)胚盘下腔显微注射注射量为2.5ul最为合适。(2)p Lenti6.4-cERE/cOVP-EGFP转染细胞后,cERE/cOVP启动子能够成功启动EGFP在HEK 293T细胞和鸡原代输卵管上皮细胞中表达,说明该启动子能够发挥启动功能。(3)成功构建了 PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP 和 PB-Dual-CMV-y-hIFN-P2A-RFP转座子载体,分别转染HEK 293T细胞和鸡原代输卵管上皮细胞,通过显微镜观察荧光表达、RT-PCR、细胞免疫荧光和Western Blot检测到了 y-hIFN和RFP基因的表达。(4)对45枚种蛋进行鸡胚盘下腔注射转座子载体PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP,孵化14天后鸡胚存活17枚,存活率为37.78%,取鸡胚的心脏和性腺组织提取基因组DNA,进行PCR检测目的基因整合效率,最终在4个鸡胚心脏组织、2个性腺组织DNA样本中检测到了γ-hIFN基因的整合,其中1个样本在心脏和性腺组织DNA中同时检测到了γ-hIFN基因的整合。本研究初步证明了转座子载体能够介导γ-hIFN[基因整合至鸡胚基因组,为PiggyBac转座子介导输卵管特异性表达γ-hIFN转基因鸡研究奠定了基础。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;S831
【图文】：

图１－１邋ＰｉｇｇｙＢａｃ转座子转座机制逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋ＰｉｇｇｙＢａｃ邋ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ｍｅｃｈｎｉｓｉｍ逡逑３鸡胚换壳培养体系逡逑与哺乳动物受精卵不同的是，鸡的受精卵结构比较特殊。鸡的受精卵在体内受

２．邋６讨论逡逑本实验首先对鸡胚换壳培养操作流程进行了研宄，结合实验室操作条件，对部分逡逑操作进行了优化，是整个换壳流程能够安全顺利的进行。为保证整个过程无菌，鸡蛋逡逑经过严格消毒后在超净工作台内进行切壳、换壳、封膜等操作，所有实验器材都经过逡逑高温高压消毒灭菌，确保鸡蛋的内部环境始终处于无菌状态，这是换壳之后鸡胚的继逡逑续发育的基本要求。在选择第二次换壳所需的ｓｙｓｔｅｍ邋ＩＩＩ代用蛋壳时，由于没有火鸡逡逑蛋，我们采用容易购买的重量符合要求的双黄蛋作为替代品，并证明双黄蛋壳可以用逡逑作ｓｙｓｔｅｍ邋ＩＩＩ代用蛋壳，通过不断地改进换壳培养的操作流程最终获得了邋３３．５１％的平逡逑均出壳率。在操作中根据李赞东等［５２］等提出的封口膜通透性不够水分蒸发会在封口膜逡逑上形成水珠影响鸡胚的发肓，我们选用了通透性更好的ｐａｒａｆｉｌｍ封口膜，再保持蛋壳逡逑内部无菌的同时使水分能够透过封口膜散发出去，避免了在封口膜内部形成水珠。在逡逑正常孵化过程中翻蛋的角度也是一个重要的影响因素，Ｇｏｔｏ等［８９］人曾尝试不翻蛋的情逡逑况下进行孵化仅获得了邋２１．３％的出壳率，日本的研究人员指出当翻蛋角度大于４５°时逡逑

【参考文献】

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本文编号：2723006