猪流行性腹泻病毒（PEDV）S蛋白高变区（1-496aa）线性B细胞表位肽的鉴定

发布时间：2020-06-22 02:21

【摘要】：猪流行性腹泻(Porcine epidemic dirrhea,PED)是由猪流行腹泻病毒(Porcine epidemic dirrhea virus,PEDV)引起的一种急性、高传染性猪肠道疾病。其临床症状主要表现为腹泻、呕吐、脱水、厌食和迅速消瘦等,虽然各种年龄阶段的猪对PEDV都易感,但10日内的仔猪对PEDV更易感,致死率高达100%。1971年,世界上第一例PED暴发于英格兰地区的架子猪和育肥猪群中,症状只是表现为腹泻。1984年,宣华等首次证实我国某些地区猪群中也存在PEDV感染。2010年底开始,我国从南到北,从东到西的很多地区猪场的仔猪腹泻疫情暴发,并伴随着新的流行特征出现,尤其是发病率和死亡率高,造成100万头仔猪死亡,一周龄仔猪死亡率竟高达80%-90%,给我国养猪业带来了巨大的经济损失。针对PEDV经典毒株(CV777)的传统疫苗不能对新流行PEDV毒株提供良好的保护;目前,对于造成PEDV新流行毒株高致病性的机制尚不明确。抗原变异是导致PEDV经典株弱毒/灭活疫苗对目前流行毒株免疫失败的主要原因之一。PEDV S蛋白在病毒感染宿主细胞的吸附、入侵以及膜融合等过程中发挥重要作用;S蛋白也是诱导宿主产生中和性抗体的主要靶蛋白之一。猪流行性腹泻病毒经典毒株与流行毒株S蛋白氨基酸序列比对显示,其s基因发生了明显的变异,且在S蛋白的N-端存在一个高变区(1-496aa,S1_(0A))。为了找出S蛋白高变区因基因突变导致的表位改变,在表位水平解析PEDV新流行毒株的免疫逃避现象,本文主要进行了以下研究:1.PEDV S蛋白高变区(S1_(0A))表达载体的构建以带有经密码子优化的PEDV CV777疫苗株和新流行株PEDV SD2014 s基因的重组载体为模板,设计特异性引物PCR扩增PEDV经典株s基因高变区片段(s1_(0A)~(CV777))和流行株s基因高变区片段(s1_(0A)~(SD2014)),构建2个表达载体pET-32a-S1_(0A)~(CV777)和pET-32a-S1_(0A)~(SD2014);将测序验证正确的PEDV S1_(0A)蛋白重组表达质粒转化E.coli BL21感受态细胞,采用IPTG诱导2段重组蛋白的表达;并对诱导条件如IPTG浓度、温度进行了优化,确定在IPTG浓度在0.8 mmol/L,37℃条件下重组蛋白表达量较高,并且重组蛋白是以包涵体的形式存在于菌体中。2.免疫新西兰大白兔制备PEDV S蛋白高变区多克隆抗体在最优条件下大量表达重组蛋白,超声波破碎菌体,离心收集包涵体重组蛋白,并采用SDS-PAGE割胶和电洗脱方法纯化包涵体蛋白。将纯化的2段蛋白各免疫3只新西兰大白兔(0.5 mg/只),另外设置一只兔子为对照组,相同的方法注射PBS。每隔14 d加强免疫1次,共免疫4次;分别于第一次免疫后的第14、28、42、56 d耳部静脉取血,第58 d颈动脉放血后间接ELISA检测抗体水平,6只兔子的抗体滴度都高于1:1 638 400,表明免疫得到的多抗兔血清具有良好的敏感性;免疫组化和免疫荧光显示获得的抗S1_(0A)~(CV777)和抗S1_(0A)~(SD2014)多克隆抗体都具有很好的特异性。3.PEDV S1_(0A)~(CV777)和S1_(0A)~(SD2014)线性B细胞表位区筛选设计并合成覆盖PEDV经典株和流行株S蛋白高变区(1-496aa)全长的互有8 aa重叠的系列16肽编码DNA,体外退火后插入到表达载体pXXGST-3中,构建表达载体pXXGST-3-P1~P61,将序列验证正确的重组质粒转化E.coli BL21感受态细胞,分别以抗S1_(0A)~(CV777)多抗血清和抗PEDV S1_(0A)~(SD2014)多抗血清为一抗Western blot筛选覆盖S1_(0A)~(CV777)和S1_(0A)~(SD2014)序列全长、彼此重叠8 aa的系列16肽中的阳性反应性16肽。利用抗PEDV S1_(0A)~(CV777)多抗血清和抗S1_(0A)~(SD2014)多抗血清在PEDV S1_(0A)~(CV777)上共鉴定到34个阳性反应性16肽。其中,16个为两种血清共同识别的表位肽,12个为抗PEDV S1_(0A)~(CV777)血清特异性识别的表位肽,6个为抗S1_(0A)~(SD2014)血清特异性识别的表位肽;利用抗PEDV S1_(0A)~(SD2014)多抗血清和抗S1_(0A)~(CV777)多抗血清在PEDV S1_(0A)~(SD2014)上共筛选到28个阳性反应性16肽,其中,13个为两种血清共同识别的表位肽,12个为抗PEDV S1_(0A)~(SD2014)血清特异性识别的表位肽,3个为抗S1_(0A)~(CV777)血清特异性识别的表位肽。
【学位授予单位】：齐鲁工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.651
【图文】：

统计报告证实：截止到 2013 年，在有关政府和科学家的共同努力下，家的 PED 疫情得到了有效控制。截止目前，美洲国家如美国、阿根廷、哥伦比亚、墨西哥、加拿大、墨西哥等，亚洲国家如韩国[9]、越南、日本、菲律宾、中国和泰国等，欧洲国家如比利时、英国、法国[8]和荷兰等的养猪行业都受到了 PED 的巨大冲击。 PEDV 形态和理化性质(1) PEDV 形态PEDV 具有感染性，是尼多病毒目冠状病毒科α-冠状病毒属成员[1]，是一种的正链单股线性 RNA 病毒。PEDV 病毒粒子呈现多形性或为球形，直径90 nm，其中包括长约 18 nm 的突出部分[1]，基因组核苷酸大约为 28000 nt[15发现的 PEDV 只有一种血清型[16]。在电子显微镜下观察其病毒粒子，在囊纤突，其排列规则且由核心向周围放射呈现皇冠的形态，因此被称为冠状其结构如图 1.1 所示。

齐鲁工业大学硕士学位论文蛋白（M，27-32 kD）、囊膜蛋白（E，7 kD）和核衣壳蛋白（N，55-58 kD）以及非结构蛋白 ORF3 蛋白。结构模式如图 1.3 所示[15,18]。在 PEDV 所有的基因组中，复制酶基因 1a 和 1ab 作用是编码非结构蛋白（即复制酶蛋白 1a 和 1ab），其长度占所有基因组的三分之二。非结构蛋白在 PEDV 复制、装配和逃避宿主天然免疫中发挥重要的作用。

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本文编号：2725034