NLRP9在仔猪组织中的表达、定位及在IPEC-J2细胞中的功能研究

发布时间：2020-06-22 03:39

【摘要】：本试验以仔猪不同组织和猪肠上皮细胞系IPEC-J2为研究对象,利用生物信息学对猪NLRP9蛋白的结构、理化性质以及相互作用蛋白进行分析预测;利用实时荧光定量PCR、免疫印迹、免疫组化和免疫荧光等试验方法研究NLRP9蛋白在仔猪11种不同组织以及肠上皮细胞系IPEC-J2中的表达与定位;采用RNA干扰与添加脂多糖等试验方法研究NLRP9基因在肠上皮细胞IPEC-J2中的功能。结果如下:在NCBI数据库中获得猪NLRP9基因和蛋白序列并进行生物信息学分析。结果表明,NLRP9基因定位在6号染色体上,编码996个氨基酸,分子量113.8 KDa,理论等电点为5.56,分子式为C5113H8038N1316O1476S703。该蛋白无信号肽和跨膜区域,其二级结构包括55.72%的α-螺旋结构、8.94%的β-转角、19.68%的无规卷曲和25.66%的延伸链。保守结构域为PYRIN、NACHT与LRR,进一步分析显示NRLP9蛋白可能与NLRC4和CSRNP1蛋白存在相互作用关系。利用RT-PCR、qRT-PCR、免疫印迹、免疫组化和免疫荧光研究了 NLRP9蛋白在仔猪不同组织中的表达和定位。结果表明,NLRP9mRNA及其蛋白在选取的11种组织中均有表达,利用免疫组化以及免疫荧光技术进一步分析NLRP9在猪小肠、卵巢和睾丸中的定位,结果显示NLRP9蛋白主要定位在小肠上皮细胞,卵巢卵母细胞和颗粒细胞以及睾丸间质细胞。荧光定量PCR和免疫印迹分析表明NLRP9 mRNA及其蛋白在猪肠上皮细胞系IPEC-J2中均能检测到表达。免疫荧光结合激光共聚焦显微镜技术进一步证实该蛋白主要定位在IPEC-J2的细胞质。利用RNA干扰技术沉默NLRP9基因并用MTT法检测细胞活性,结果发现IPEC-J2细胞活性并未受太大影响,但细胞生长速度变慢。再用不同浓度的LPS处理细胞并在体外培养12小时,检测到NLRP9mRNA和蛋白在IPEC-J2细胞中的表达量会随着LPS浓度的增加而增多,细胞活性也明显增强。
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S828
【图文】：

图２－１猪ＮＬＲＰ与其他物种的ＮＬＲＰ９系统生化数逡逑

蛋白,预测结果,亲疏水性,软件分析

数为－０．０１８，所以该蛋白为亲水性蛋白，利用ＥＸＰＡＳＹ逡逑（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ／）在线软件分析ＮＬＲＰ９蛋白的亲疏水性，结逡逑果显示在１０２位分值最低为－２．６５６，在３４７位最高值为２．４２２，见图２－２和２－３。逡逑ｆｔ邋ＶＥＢＳＥｖｉ？ＪＥ？；Ｅ邋Ｌｅｎｇｔｈ邋９９６逡逑ｎ邋ＷＥＢＳＥｗＵＥＷ＾邋Ｒｕ？ｂｅｒ邋ｏｆ邋ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ邋ＴＭＨｓ邋０逡逑８邋ＷＥＢ３ＥｙＵＥ？：Ｅ邋ＥｘＰ邋ｎｉａｋｂ＾ｉ邋ｏｆ邋Ｍｒ邋ｍ邋ＴＭＨｓ邋０．７１５８９逡逑８邋ＶＥＢＳＥＱＴＪＥＷ３Ｅ邋Ｅｘｐ邋ｎ＇ｍｂｅｉ，邋ｆｉｒｓｔ邋６０邋ＡＡｒ邋０逡逑８邋ＶＥＢ３Ｅ＇ｊＵＥ？：Ｅ邋Ｔｏｔａｌ邋ｐｒｏｂ邋ｏｆ邋Ｎ－ｍ逦０．邋００００３逡逑ＷＨＢＳＥＱＵＥＷ．＇Ｅ邋ＴＨＨＭＭ２．０逦ｏｕｔｓｉｄｅ邋１逦９９６逡逑ＴＭＨＭＭ邋ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ邋ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓ邋ｆｏｒ邋ＷＥＢＳＥＱＵＥＮＣＥ逡逑１２邋逦逦逦逦逦逦逦逦逦逦逦■逦逦逦逦逦逦逦逡逑坌0８逡逑■邋０６邋？逡逑０４邋？逡逑０２邋■逡逑０邋逦１逦１逦１逦１逦逦逦１逦１逦１￣祖…１逦——逡逑０逦１００逦２００逦３００逦４００逦５００逦６００逦７００逦６００逦９００逡逑ｔｒａｎｓｍｅｒＴｉｂｒａｎｅ邋逦邋ｉｎｓｉｄｅ逦逦ｏｕｔｓｉｄｅ邋逦逡逑图２－２邋ＮＬＲＰ９蛋白跨膜区域预测结果图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＮＬＲＰ９邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｒｅ

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