基于CMV启动子NDV基因Ⅶ型NA-1株活载体构建及免疫特性评价

发布时间：2020-06-26 00:12

【摘要】：新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）也被称为禽副黏病毒1型（avianparamyxovirus serotype-1，APMV-1)，广泛分布于世界各地，严重危害全球家禽养殖业健康发展。NDV只有单一血清型，但存在多种基因型，当前NDV在世界范围内呈现以class II中基因VII型为主，其他基因型散发的流行态势。然而在NDV的免疫预防上，半个多世纪以来国内外一直沿用经典基因II型弱毒疫苗株，由于基因型与抗原性的不匹配，当前广泛应用的弱毒疫苗株不能完全阻止病毒感染，并且受到强毒攻击后排毒现象严重，即使在免疫家禽群体中依然有强毒株不断被分离的报道。反向遗传操作技术的发展，尤其是理想的病毒拯救系统，为深入研究NDV结构与功能关系、致病机制提供了有力工具，为研发与流行毒株相一致的基因VII型NDV弱毒疫苗候选株及候选疫苗载体提供了新的思路。本研究以鹅源基因VII型NDV NA-1株为研究对象，建立以CMV为启动子利用真核细胞广泛存在的RNA聚合酶Ⅱ的反向遗传操作系统，该系统不依赖传统T7RNA聚合酶，操作简便高效。在此基础上，将NDV NA-1株F蛋白裂解序列从强毒株特征基序突变为弱毒特征基序，从而获得基因VII型NDV致弱疫苗候选株及候选载体rmNA-1。为探索重组NDV表达两个甚至多个外源蛋白的可能性，本研究以红色荧光蛋白基因和绿色荧光蛋白基因为报告基因，构建同时表达双外源基因重组新城疫病毒rmNA-mCh-GFP，结果表明以NDV为载体具有构建重组多联、多价疫苗或开发可携带多种免疫分子的肿瘤治疗载体的潜力；以此鹅源NDV致弱株为活病毒载体，构建表达鹅细小病毒VP3保护性抗原蛋白重组新城疫病毒rmNA-VP3，并对其生物学特性及雏鹅免疫特性进行了评价，主要内容如下： I．基于CMV启动子NDV NA-1株反向遗传操作系统的建立根据本实验室分离并保存的鹅源基因VII型NDV NA-1株基因组序列，将全基因组分为7个末端部分重叠的基因片段进行分段克隆，利用邻近片段重叠部分的限制性酶切位点通过体外拼接组装成完整基因组cDNA，并分别在5’端和3’端引入锤头状核酶（HamRz）序列和丁型肝炎病毒核酶（HdvRz）序列，以产生精确的病毒基因3’末端和5’末端，克隆于真核表达质粒pCI-neo中CMV启动子的下游，构成NDV NA-1全基因组cDNA克隆pCI-NA-1。同时分别将NP、P和L基因ORF，克隆至真核表达载体pcDNA3.1中CMV启动子的下游，构成三个辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L。共转染全长质粒pCI-NA-1与三个辅助质粒于BHK-21细胞拯救获得具有感染性的子代病毒。同时以eGFP为报告基因，构建了表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒，为今后制备新型基因VII型新城疫病毒活载体研发双价或多价疫苗奠定了基础。 II．鹅源基因VII型新城疫病毒NA-1致弱株的构建为构建与当前流行毒株基因型抗原性相匹配的基因VII型新城疫病毒弱毒疫苗候选株及疫苗载体，在已建立的NDV NA-1株简便高效的反向遗传操作系统基础上，将NDV NA-1株天然典型强毒株特征的F蛋白裂解位点112RRQKR↓F117替换为弱毒疫苗株LaSota F裂解位点相应基序112GRQGR↓L117，拯救获得突变修饰株rmNA-1，致病性分析结果显示突变株rmNA-1致病力显著降低，致病类型从强毒株变为弱毒株，成功实现对病毒的致弱，而且突变致弱株rmNA-1具有和亲本株rNA-1相似的生长动力学曲线，并且连续传代10次，突变碱基仍然具有稳定性，不发生回复突变或其他突变，为制备新型基因VII型新城疫病毒弱毒疫苗候选株及候选载体奠定了基础。 III.表达双荧光蛋白重组新城疫病毒的构建及其生物学特性评价为探索重组NDV表达两个外源保护性抗原蛋白构建重组多联或多价疫苗或研制可携带多种免疫分子的肿瘤靶向性治疗制剂的可能性，本研究以绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白mCherry为外源蛋白，将两者编码序列以内部核糖体进入位点（IRES）相连构成单独转录单位，插入到新城疫病毒基因组中，构建同时表达双荧光蛋白重组新城疫病毒rmNA-mCh-GFP，红色荧光蛋白mCherry和绿色荧光蛋白GFP在重组病毒感染细胞同时获得了正确表达，且不影响病毒其他蛋白的表达。表达双荧光蛋白重组病毒rmNA-mCh-GFP具有与母本株rmNA-1相似的体外生长曲线，尽管在最高生长滴度上与母本株相差约25倍，但rmNA-mCh-GFP仍具有较高的生长滴度。表明重组NDV具有同时表达两个甚至多个外源蛋白的潜力。 VI.表达GPV VP3蛋白重组新城疫病毒的构建及其免疫原性分析克隆鹅细小病毒VP3基因ORF构成完整NDV基因表达盒，插入上述NDV突变致弱株rmNA-1基因组P和M之间，构成表达鹅细小病毒VP3蛋白重组新城疫病毒rmNA-VP3。通过免疫荧光染色、Western blot检测证实外源蛋白VP3可获得正确有效的表达，与母本株rmNA-1相比，rmNA-VP3拥有更低的致病力，并保持母本株良好的遗传稳定性，将rmNA-VP3分别在鸡胚中连续传代10次，外源基因VP3稳定遗传且F裂解位点修饰碱基仍然具有稳定性，不发生回复突变或其他突变。在鸡胚生长特性上，重组病毒rmNA-VP3具有与rmNA-1及野生型rNA-1相似的生长趋势，但由于外源基因的插入病毒滴度达到高峰的时间略晚，滴度峰值低于母本毒约20倍左右，以此表达鹅细小病毒VP3蛋白重组新城疫病毒免疫雏鹅显示出良好的免疫原性，整个免疫观察期无疫苗相关临床症状出现，且可同时诱导产生坚实的鹅细小病毒和新城疫病毒中和抗体，表明重组病毒rmNA-VP3具有免疫预防鹅细小病毒和新城疫病毒感染的潜力，同时，rmNA-1可作为病毒活载体表达外源蛋白而不影响其本身免疫原性。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【图文】：

新城疫病毒,结构模式,疫病

疫病毒分子生物学疫病毒分类地位与形态特征病毒（Newcastle Disease Virus, NDV）因首次分离于英格子呈多形性，一般近似球形，有时也可呈长丝状，成熟的-250nm，外披有来自宿主细胞膜的磷脂双分子层的囊膜，由血凝素神经氨酸酶（Haemagglution-Neuraminidase，HN protein，F）构成的两种大小不同的纤突，内面附有一层蛋白（Matrix protein，M），病毒粒子的内部为核衣壳蛋sphoprotein，P）、大分子蛋白（Large protein，L）和单链对称的核衣壳，病毒粒子的结构参见图 1。

编码序列,新城疫病毒,结构蛋白

第一篇文献综述第 2 章新城疫病毒反向遗传学研究进展必须的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白的编码序列的辅助质粒即表达 NP L 三种结构蛋白的真核质粒，用以装配病毒的核衣壳。包含病毒反基因组的壳一方面作为模板合成病毒的 RNA，另一方面转录翻译出各结构蛋白，配出子代病毒颗粒。

【参考文献】