谷氨酸对热应激致奶牛肠上皮细胞损伤的修复作用

发布时间：2020-06-26 00:24

【摘要】：热应激是当前危害奶业生产的重要因素,有研究认为肠道上皮的损伤是导致热应激致奶牛大幅减产的核心问题,保护肠道上皮免受损伤可能是应对热应激的有效方法。谷氨酸(Glutamic acid,Glu)是奶牛肠道所需能量的主要来源,在肠道健康等方面起重要作用。因此,本试验以Glu对体外培养的热损伤奶牛小肠上皮细胞(Intestine epithelium cell,IEC)的修复机制为研究主题,初步探索Glu在奶牛小肠热损伤修复中的作用机理,为奶牛业热应激问题找到有效解决途径。试验一:奶牛小肠上皮细胞原代培养方法研究分别采用灌肠消化法、机械刮取+酶解法(先使用胶原酶Ⅺ消化30min,再使用胰蛋白酶消化)对小肠上皮组织进行分离。结果显示:通过机械刮取+酶解法获得的IEC数量多且细胞活性较高;分别采用差速贴壁法,差速消化法、细胞刮除法,进而对IEC进行纯化,而后采用CCK-8法测定IEC的生长曲线,并使用HE染色的方法对IEC进行鉴定。结果表明:使用差速贴壁法纯化后,IEC纯度相对较高,相差显微镜下观察发现:IEC在培养瓶底部呈现上皮细胞特有的“铺路石状”,测定的生长曲线呈“S”型,可用于后续试验。试验二:奶牛小肠上皮细胞热应激模型的建立将生长状态良好的奶牛IEC分别置于对照组(37℃)、热处理组(40℃、42℃)下处理0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h。然后分别测定各组上清液中的谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenas,LDH)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量,以及奶牛IEC中热休克蛋白、细胞间连接蛋白、炎症因子、细胞凋亡蛋白等相应基因的mRNA的相对表达量。结果显示:IEC处于热环境下,GSH-PX、SOD水平下降,LDH、MDA水平升高,细胞热休克蛋白27(Heat Shock Proteins 27,HSP27),热休克蛋白70(Heat Shock Proteins 70,HSP70),热休克蛋白90(Heat Shock Proteins 90,HSP90)基因mRNA相对表达量在42℃6 h条件下显著高于其他处理组(P0.05),热处理组occludin的mRNA相对表达量显著低于对照组(P0.05),42℃下处理6 h时抗炎因子白细胞介素10(Interleukin-10,IL-10)基因mRNA相对表达量对低,B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)与Bax的比值在40℃、42℃1 h、4 h时最高,4 h之后一直降低,8 h降至最低。因此,在42℃条件下处理细胞6 h时即产生较明显损伤效果,成功建立热损伤模型。试验三:谷氨酸对热损伤奶牛小肠上皮细胞的影响将上皮细胞置于42℃培养6 h后,在含不同浓度Glu的培养基(Glu浓度分别为4、8、12、16、20、28、36 mmol/L)中培养12 h后,收集细胞上清液和细胞。检测上清液中的抗氧化指标水平以及奶牛IEC中热休克蛋白、细胞间连接蛋白、炎症因子、细胞凋亡蛋白等相关基因的mRNA的相对表达量,研究不同浓度Glu对热损伤细胞的修复作用。结果显示:Glu浓度为8mmol/L时OD值最高;Glu浓度为8,12,16,20,28,36 mmol/L时,GSH-PX和SOD含量升高,LDH含量在Glu浓度为28mmol/L时候最低,MDA含量在Glu浓度为20mmol/L时最低;Glu浓度为36mmol/L时HSP27,HSP70,HSP90达到最高;当Glu浓度4mmol/L时,claudin-1基因mRNA相对表达量最低,当Glu浓度为8 mmol/L时,occludin基因mRNA相对表达量达到最高;低浓度组促炎因子IL-1β基因mRNA的相对表达量低于热损伤组,抗炎因子IL-10基因mRNA的相对表达量在Glu浓度为28mmol/L时高于热损伤组;Bcl-2和Bax的mRNA相对表达量均在低Glu浓度时低于热损伤组,但是,Bcl-2/Bax的值在Glu浓度为4、16、36 mmol/L高于热损伤组。由此可知,Glu对热损伤6 h的IEC具有一定的修复作用,其作用机制可能是通过促进IEC抗氧化能力,对与热休克蛋白相关的基因进行调节,并促进了与紧密连接连接蛋白相关基因的表达,减弱了促炎因子的表达,增强抗炎因子的表达,进而减少细胞凋亡,增强细胞活力。结论:通过采用机械刮取+酶解法分离细胞和差速贴壁法对分离的细胞进行纯化后,成功获得了纯度较高,活力较好、增殖能力强的奶牛IEC。将奶牛IEC置于42℃下处理6 h时,成功建立热应激模型。不同浓度的Glu添加对热损伤奶牛IEC起了到修复作用。
【学位授予单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23
【图文】：

酶解法,细胞,细胞培养

培养瓶上清液中死细胞较多；灌肠消化法分离，死细胞相对较少（如图2-1）。培养 6 d 后发现，机械刮取+酶解法细胞迁移较多，活性较高，增值能力较强；灌肠消化法细胞增殖能力较弱，细胞数量较少（如图 2-2）。灌肠消化法获得的细胞培养 10 d 时，细胞无法连接成片逐渐凋亡；而机械刮取+酶解法获得的细胞培养到第 10 d 时，细胞在瓶底分布均匀，连接成片（如图 2-3）。图 2-1 使用灌肠消化法（左图）和机械刮取+酶解法（右图）分离后培养3 d 细胞（100 ×）Fig. 2-1 Cultivation of cells for 3 d after isolate by clyster digestion (left) andmechanical scraping plus+enzymatic hydrolysis (right) (100 times)图 2-2 使用灌肠消化法（左图）和机械刮取+酶解法（右图）分离后培养6 d 细胞（100 ×）Fig. 2-2 Cultivation of cells for 3 d after isolate by clyster

酶解法,细胞,细胞培养

强；灌肠消化法细胞增殖能力较弱，细胞数量较少（如图 2-2）。灌肠消化得的细胞培养 10 d 时，细胞无法连接成片逐渐凋亡；而机械刮取+酶解法获细胞培养到第 10 d 时，细胞在瓶底分布均匀，连接成片（如图 2-3）。图 2-1 使用灌肠消化法（左图）和机械刮取+酶解法（右图）分离后培养3 d 细胞（100 ×）Fig. 2-1 Cultivation of cells for 3 d after isolate by clyster digestion (left) andmechanical scraping plus+enzymatic hydrolysis (right) (100 times)

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