同步共检PEDV，TGEV，GAR和PDCoV的可视化酶促寡核苷酸共检芯片的构建及应用

发布时间：2020-06-26 03:11

【摘要】：猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒A型(Group A rota virus,GAR)以及猪delta冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原,这四种仔猪腹泻病在临床表现非常相似,难以鉴别诊断。本研究针对PEDV、TGEV、GAR以及PDCoV四种腹泻病毒,将酶促反应显色技术、不对称PCR单链扩增技术和基因芯片技术相结合,构建一套PEDV-TGEV-G AR-PDCoV可视化酶促寡核苷酸共检基因芯片技术,进行了初步临床应用评价研究。研究结果结果显示,各目的基因的不对称PCR上下游引物最佳浓度比分别为:PEDV-S:1:20;PEDV-M:1:10;TGEV-S:1:20;TGEV-N:1:20;GAR-VP7:1:10;GAR-NSP4:1:10;PDCoV-M:1:10;PDCoV-N:1:20,此时目的片段的单链产物量最多。确定了芯片检测的操作程序为:在50℃环境中杂交90 min后,进行洗涤。与2000倍稀释的链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶酶联后用DAB显色液显色后进行结果判读。本研究根据阳性对照生成棕褐色斑点,空白对照无斑点生成,确定了芯片检测质量与结果判定标准。该可视化共检芯片特异性好,PEDV、TGEV、GAR以及P DCoV的单独检测及混合检测杂交结果均呈阳性,CSFV、PRRSV、PCV2、JEV及FMDV杂交结果呈阴性,探针之间没有相互干扰;各探针基因的灵敏性均可达10p g/μl(2.83×10~6copies/μl);芯片在保存180天后仍可进行有效检测。研究应用所构建的芯片对四川、重庆地区的200份临床送检样本进行了检测。本研究成功构建了一套能高通量检测四种仔猪腹泻疾病的酶促可视化基因芯片,该方法特异性强,灵敏度高,为临床鉴别仔猪腹泻类疾病提供了一种新的方法。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

图 1 酶促可视化寡核苷酸基因芯片技术路线图FIG. 1 The technology roadmap for the visualization of oligonucleotide gene chips.

图 1 酶促可视化寡核苷酸基因芯片技术路线图FIG. 1 The technology roadmap for the visualization of oligonucleotide gene chips.

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 Feng Rui;Liu Hai-xin;Zhong Ming;Li Xun-liang;Huang Xiao-dan;Ren Yu-dong;Li Guang-xing;;Isolation and Identification of Porcine Epidemic Diarrhea Virus(PEDV) HLJ Strain with IPEC-J2 Cells and Phylogenetic Analysis of Its S Gene[J];Journal of Northeast Agricultural University(English Edition);2019年04期

2 ;一旦肠道平衡被打破,大肠杆菌等肠道致病菌可加重PEDV感染[J];猪业科学;2019年01期

3 王睿;李雪晴;霍琳琳;李曦;;基于PEDV N蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J];黑龙江畜牧兽医;2019年11期

4 吕晓倩;田知鑫;周铁忠;王辉暖;;猪流行性腹泻病毒入侵细胞的研究进展[J];现代畜牧兽医;2019年10期

5 ;坚持不懈(泻)——汇聚PEDV防控实效经验[J];猪业科学;2018年03期

6 ;坚持不懈(泻)——汇聚PEDV防控实效经验[J];猪业科学;2018年05期

7 李鹏;吴梦郡;余魁;徐海旺;吴涛;易丹;王蕾;赵迪;侯永清;;幼龄仔猪PEDV感染肠道损伤模型的建立[J];中国畜牧兽医;2018年06期

8 丁尊俄;冯旭芳;张双翔;何贤海;胡兴义;张海;王开功;文明;程振涛;李晨;蒲翠敏;罗引幸;刘丽娟;周碧君;;贵州省PEDV与PoRV分子流行病学调查[J];基因组学与应用生物学;2018年06期

9 张丁华;王艳丰;;养猪场PEDV与其他腹泻相关病毒共感染状况及防控措施[J];黑龙江畜牧兽医;2018年14期

10 Wang Zhongze;Qin Cuili;Kong Ning;Zuo Yewen;Wang Meng;Zheng Hao;Tong Wu;Li Liwei;Yu Hai;Li Zhili;Shan Tongling;Tong Guangzhi;Li Xue;;Screening of Host Proteins Interacting with Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) N Protein by Yeast Two-hybrid System[J];Animal Husbandry and Feed Science;2018年04期

相关会议论文 前10条

1 马志倩;田阳升;郭旭阳;王文静;周恩民;肖书奇;;猪流行性腹泻病毒PEDV SX-YL株的分离与鉴定[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第九次全国会员代表大会暨第十七次全国学术研讨会论文集[C];2017年

2 Li Yongtao;Li Hongjie;Wang Xiaoxue;Wan Wenyan;Zhao Jun;;Identification of Non-structural Protein 7 of Porcine Epidemic Diarrhea Virus that inhibits Type I interferon response[A];第十一届全国免疫学学术大会摘要汇编[C];2016年

3 Liu Pinghuang;Li lin;;Isolate PEDV Specific Whole-porcine Neutralizing Antibody from Porcine Memory B cell through Single B cell PCR[A];第十一届全国免疫学学术大会分会场交流报告集[C];2016年

4 杨意;舒建洪;;PEDV全长感染性cDNA克隆的构建[A];中国生物化学与分子生物学会2016年全国学术会议论文集[C];2016年

5 王隆柏;王晨燕;吴学敏;车勇良;陈如敬;周伦江;;福建省PEDV流行病学调查与S基因变异分析[A];福建省畜牧兽医学会2015年学术年会论文集[C];2015年

6 雷喜梅;陈静;杨盼盼;赵永祥;王晓梦;赵军;王川庆;;分泌抗PEDV变异株S蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立[A];中国畜牧兽医学会2014年学术年会论文集[C];2014年

7 董世娟;朱于敏;于瑞嵩;李震;;我国PEDV分子流行病学研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集[C];2013年

8 胡兴义;张双翔;王开功;文明;周碧君;程振涛;张海;;猪流行性腹泻病毒疫苗免疫后乳汁中PEDV IgA消长动态研究[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第九次全国会员代表大会暨第十七次全国学术研讨会论文集[C];2017年

9 陈苏;周晗;王丽;乔薪瑗;徐义刚;唐丽杰;李一经;;表达PEDV保护性抗原靶向融合肽乳酸杆菌活菌载体的构建及其免疫原性分析[A];中国畜牧兽医学会生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十二次学术研讨会论文集[C];2016年

10 高玉;葛旭影;曹丽艳;李训良;任玉东;任晓峰;李广兴;;猪流行性腹泻病毒M蛋白亲和肽筛选及其抗病毒作用[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十一次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第二十次学术研讨会论文集[C];2015年

相关重要报纸文章 前4条

1 记者 黄辛;猪流行性腹泻病毒研究获进展[N];中国科学报;2012年

2 上海巴斯德研究所;中科院揭示猪流行性腹泻病毒ORF3蛋白的功能[N];中国畜牧兽医报;2012年

3 北京海正兴潮生物技术有限公司 周海云;猪流行性腹泻的综合防控措施[N];中国畜牧兽医报;2014年

4 记者 刘辛味;源头又是蝙蝠[N];北京科技报;2018年

相关博士学位论文 前10条

1 雷喜梅;猪流行性腹泻病毒血清学与抑制病毒入侵细胞的研究[D];浙江大学;2018年

2 周兴东;在细胞超微结构水平上研究氯喹及PEDV对自噬的影响[D];东北农业大学;2017年

3 李中华;PEDV感染猪空肠组织的蛋白质组学分析及hnRNP A1影响PEDV复制的作用机制研究[D];华中农业大学;2018年

4 苏运芳;猪流行性腹泻病毒遗传变异分析及S1蛋白N端区域对病毒复制的影响[D];西北农林科技大学;2018年

5 袁晓民;TGEV和PEDV重组猪痘病毒活载体疫苗的效力及载体生物安全评价[D];南京农业大学;2017年

6 李亮;猪肠类器官模型的建立及干扰素λ在肠道黏膜免疫中抗猪流行性腹泻病毒（PEDV）作用机制的研究[D];中国农业科学院;2019年

7 郑红青;PEDV感染的猪小肠上皮细胞miRNA组学分析和miR-221-5p与miR-615对病毒复制的影响及机制[D];西北农林科技大学;2019年

8 孙彦刚;猪流行性腹泻病毒纤突蛋白在病毒入侵和免疫反应中的作用研究[D];吉林大学;2019年

9 王兴叶;猪流行性腹泻病毒高增殖Vero细胞选育、分离鉴定及致肠道靶细胞SIEC病理机制研究[D];西北农林科技大学;2018年

10 赵鹏伟;猪流行性腹泻病毒流行株的分离鉴定及生物学特性研究[D];中国农业大学;2018年

相关硕士学位论文 前10条

1 谢洋洋;猪流行性腹泻病毒S蛋白在侵染细胞中的作用机制研究[D];上海交通大学;2018年

2 赵晶;PEDV S1 S2蛋白抗原多表位片段的单克隆抗体制备及表位初步分析[D];上海交通大学;2016年

3 朝木丽格;PEDV S2基因的B细胞表位嵌入型S-层蛋白载体的构建及其抗原性分析[D];内蒙古农业大学;2019年

4 王睿敏;猪四种腹泻病毒快速鉴别检测方法及猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究[D];广西大学;2019年

5 仝帅;2016-2018年山东省部分地区猪病毒性腹泻的感染情况调查[D];山东农业大学;2019年

6 王加圆;猪流行性腹泻病毒S1蛋白抗原位点的串联表达及免疫效果评价[D];扬州大学;2019年

7 刘志鹏;同步共检PEDV，TGEV，GAR和PDCoV的可视化酶促寡核苷酸共检芯片的构建及应用[D];四川农业大学;2018年

8 陈雷;猪流行性腹泻病毒流行株的分离鉴定及自噬对病毒增殖影响[D];南京农业大学;2017年

9 周川杰;CVC1302/CVC1303对PEDV灭活疫苗免疫增强机制初探[D];南京农业大学;2017年

10 王添翔;抑制PEDV黏附的猪源乳杆菌的分离鉴定及其S层蛋白在抑制PEDV黏附中的作用[D];南京农业大学;2017年

本文编号：2729735