狐伪狂犬病间接ELISA检测方法的建立

发布时间：2020-06-26 16:53

【摘要】：伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种危害动物繁殖系统、神经系统的急性传染病。伪狂犬病病毒可感染多种哺乳动物,如猪、鼠、貉、水貂和狐等。2011年,我国多个省份的生猪养殖场暴发了PRV疫情,且此次流行的毒株导致Bartha疫苗株难以对猪群提供全面保护。该毒株不仅使猪群发病,还导致狐等毛皮动物发病。当狐感染PRV后,表现出神经性瘙痒、呼吸困难、精神狂躁或沉郁等临床症状,体温变化多表现为“回归热”,发病的狐多以死亡为转归,给养狐业带来巨大的经济损失。为更好的防控该病,通过对狐PRV的分离鉴定,以gB蛋白的原核表达和HRP酶标二抗的制备为基础,建立狐PRV间接ELISA检测方法,用于狐PRV抗体的检测。采集2017~2018年间送检的疑似感染PRV的病死狐的脑组织样品30份,经PCR鉴定其中6份样品为PR阳性,阳性率为20%。将阳性的病料进行病毒分离,通过PCR和间接免疫荧光试验对分离的病毒进行验证,超速离心纯化后经透射电镜观察该病毒粒子的形态结构,证实分离株为PRV,命名为HBfox-25。测得病毒的TCID_(50)为10~(-5.6)/0.1 mL,经动物回归试验,狐出现神经异常、皮肤瘙痒并撕咬接种部位等症状,5d后死亡。本研究通过PCR技术扩增出HBfox-25的gB基因,并将目的片段与表达载体pET-32a连接,得到重组质粒pET-32a-gB。再将得到的质粒转化至大肠杆菌BL21,37℃震荡培养,待菌液生长至对数期时用IPTG诱导蛋白表达。最后经紫外分光光度计测得纯化后的蛋白浓度为1 mg/mL。通过棋盘滴定法来确定抗原最佳包被浓度。通过饱和硫酸铵法粗提狐血清中的IgG,过柱纯化。将纯化后的IgG免疫兔获得兔抗狐抗体,通过改良的二步法将纯化后的抗体进行HRP标记。从而建立狐PRV间接ELISA检测方法。经验证,本研究建立的狐PRV间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性。该方法的建立为狐PR的诊断和流行病学调查提供了新的技术支持。
【学位授予单位】：河北科技师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.92
【图文】：

病毒粒子,伪狂犬病病毒,病毒

图 1-1 PRV 病毒粒子结构Fig. 1-1 Structure of PRV virion1.3.2 伪狂犬病病毒的理化特性伪狂犬病病毒又称疱疹病毒I型，在所有的疱疹病毒中其抗逆性最强。在外界环境中的存活时间的长短主要受环境的温度和pH值的影响。该病毒耐热性强45～55℃下30～50 min才能使其失去感染力，80℃ 3 min的条件下也能对该病毒进行灭活；pH在4～9之间较稳定，在过酸或过碱的环境下病毒能很快失活[23]。在0～6℃的条件下，将病料用50%的甘油盐水浸泡154 d，只能减弱该病毒的感染力，当保存到3年的时候仍然对动物具有感染力；病毒在腐烂的病料中抵抗力略差，约保存11d左右就失去了感染能力。伪狂犬病病毒对福尔马林和紫外线照射敏感，病毒在距离为27 cm时15 W紫外灭菌灯可以使病毒失活。伪狂犬病病毒对酶类也比较敏感，胰蛋白酶能灭活伪狂犬病毒[24]。采用浓度为 0.5%～1%的氢氧化钠能迅速灭活伪狂犬病病毒；将病毒培养物真空冷冻干燥后在-70℃条件下可以保存许多年[25]。通过试验表明，往病毒悬浮液里面加入适量的蔗糖、左

盲传,细胞,伪狂犬病病毒,收毒

置于 1%的琼脂糖凝胶上进行电泳。对电泳结果进行记录和拍照。出现与预期结果相一致的大小约为 286 bp 的目的条带（图 2-1），证明该动物 PRV 的感染。图2-1 样品检测结果Fig. 2-1 Sample test ResultsM:DL2000 Marker; 1:阳性对照;2:阴性对照;检测样品:3、4、5、6、7、8；M:DL2000 Marker; 1:Positive control; 2:Negative control; Test samples:3、4、5、6、7、8;2.3.2 病毒的分离与传代取冻于-80℃破碎组织上清解冻后经 0.22 μm 滤器过滤，取 400 μL 接种至铺至细胞瓶底部 90％的 MDCK 细胞中感作，1 h 后换细胞维持液，48 h 后反复冻融三次收毒，再进行盲传。当盲传至第四代，培养 24 h 后，MDCK 细胞出现 CPE。具体表现为细胞出现膨胀、折光度增加、形成合胞体且具有树突状突出、形成拉网状最终细胞脱落的现象。这些病变特征属于伪狂犬病病毒感染细胞后的标志性特征(图 2-2)。

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