发酵乳杆菌对LPS诱导的牛子宫内膜细胞炎性损伤调节作用的研究

发布时间：2020-06-27 01:42

【摘要】：[目的]近年来对奶牛养殖业造成巨大损失的原因之一就是子宫内膜炎,其多见于产后,且多为隐性。研究者们一直在钻研更安全更高效的治疗方法。益生菌的应用是最近几年的热点话题,它的好处是无毒安全,在对动物后不会产生药物残留,当动物没有疾病时还可以起到加强动物机体的免疫力,起到预防疾病的作用。本试验旨在于通过对炎性因子以及炎性通路关键基因的测定来研究发酵乳杆菌对LPS诱导的牛子宫内膜细胞的调节作用,为发酵乳杆菌的临床应用提供依据。[方法]在实验室稳定传代培养牛子宫内膜细胞,通过CCK-8的方法确定LPS(脂多糖lipopolysaccharide)作用于细胞的最适浓度和时间;通过16SrDNA序列分析及同源性比较,鉴定购买菌种的准确性,用CCK-8法发酵乳杆菌与LPS共同作用细胞的最适浓度;利用ELISA法测定IL-1β,IL-6,IL-8,TNF-α的含量,确定炎性因子分泌量的变化;采用实时荧光定量PCR检测IL-1β,IL-6,IL-8,TNF-α炎性因子和TLR4、NF-κB(P65)、MyD88炎性通路基因的表达量。[结果]采用CCK-8法检测发现:LPS在较短的作用时间内没有表现出毒性作用,相反低浓度刺激会起到轻微的促进细胞生长作用,但较长时间会对牛子宫内膜细胞产生炎性损伤作用,当作用时间为24h、浓度为80μg/mL时,与对照组相比,牛子宫内膜细胞的相对存活率显著降低(p0.05),当浓度大于80μg/mL时,与对照组相比,牛子宫内膜细胞的相对存活率降低的更为显著(p0.01),当作用时间为48h,LPS发挥了强效的毒性作用,与对照组相比,牛子宫内膜细胞的相对存活率极显著降低(p0.01);LPS与发酵乳杆菌联合作用于牛子宫内膜细胞,短时间内发酵乳杆菌可缓解LPS引起的细胞毒性作用,作用时间为2h、浓度为10~8CFU/mL时,与对照组相比,牛子宫内膜细胞的相对存活率显著升高(p0.05),但发酵乳杆菌长时间刺激作用也会起到毒性作用;采用酶联免疫吸附法检测发现:与对照组相比,LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8四种炎性细胞因子的分泌量极显著升高(p0.01);与LTA组相比,LPS+LF组IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α四种炎性细胞因子的分泌量显著降低(p0.05);与对照组相比,LF(发酵乳杆菌Lactobacillus fermentum)组可不同程度地提高四种炎性细胞因子的分泌量(p0.05,p0.05),但相比于LPS组的升高,LF组属于正常的应激反应。由此表明,发酵乳杆菌可缓解由LPS诱导产生的牛子宫内膜细胞炎性细胞因子的过度分泌;采用实时荧光定量PCR法检测发现:与对照组相比,LPS组IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、TLR4、MyD88、NF-κB(p65)基因mRNA的相对表达量极显著升高(p0.01);与LPS组相比,LPS+LF组TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、TLR2、MyD88、NF-κB(p65)基因mRNA的相对表达量极显著降低(p0.01);与对照组相比,LF组7种基因mRNA的表达量有不同程度的升高(p0.05,p0.05,p0.01),但均低于LPS组,在正常应激反应范围内。由此表明,发酵乳杆菌可极显著降低由LPS诱导造成的炎性相关基因mRNA的高表达。[结论]1、80μg/mL的LPS孵育细胞24h,可以建立良好的子宫内膜细胞炎症损伤模型;2、发酵乳杆菌能降低炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的含量,同时可以降低TLR4、NF-κB、MyD88炎性通路基因以及IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α炎性因子的基因表达,说明此发酵乳杆菌对于LPS诱导的牛子宫内膜细胞的炎症模型有调节作用,为临床应用提供理论依据。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.23
【图文】：

存活率,检测结果,标签,空白

图 1 LPS 对子宫内膜细胞相对存活率的检测结果（6h）ults of LPS on the survival effiency of endometrial epithelial cells（注：数据标签中，“**”、“*”分别代表与空白组相比，差异极显著和差异显著。（下同）mpared with control group，“**”、“*” respective represented significant difference and difference, the sam图 2 LPS 对子宫内膜细胞相对存活率的检测结果（12h）

存活率,检测结果,标签,空白

【参考文献】