外泌体携带microRNAs促进新城疫病毒复制

发布时间：2020-06-27 20:55

【摘要】：外泌体(exosome,Exo)是一类由细胞主动分泌释放到胞外的小囊泡,直径大小约在30-150 nm。它凭借自身能在细胞间传递蛋白,核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA),脂类等生物活性物质而在细胞间通讯中发挥着关键作用。近年来,已有相当多关于外泌体与病毒感染的研究报道,尤其是外泌体在人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)和丙型肝炎病毒(the Hepatitis C virus,HCV)感染中生物功能的研究。然而,目前仍未有关于外泌体在新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染中的相关报道。MicroRNA(miRNA),作为非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)家族成员之一,通过mRNA剪切和抑制蛋白质翻译的方式负调控靶基因,参与多个生理和病理过程。在病毒感染中,已发现多种microRNA也能调节病毒的复制,然而与NDV感染相关的microRNA仍鲜有报道。得到高质量的外泌体样品是外泌体与NDV感染研究进行的第一步。为此,我们利用差速离心法分离,并通过透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM),纳米颗粒捕捉技术(Nanosight Tracking Analysis,NTA),蛋白质免疫印迹(Western blotting,WB)等不同方法鉴定出可靠有效的HeLa细胞分泌的外泌体,同时发现将NDV感染的HeLa细胞外泌体纯化后孵育DF-1细胞,与对照组相比呈现出明显细胞病变,暗示该外泌体能增强NDV感染HeLa细胞。采用Microarray芯片技术检测新城疫感染组与未感染组的HeLa细胞外泌体内miRNA表达谱差异,结果发现236个宿主miRNA发生了两倍以上的表达差异,其中145个miRNA呈现显著上调。经过生物信息学软件初步预测筛选出25个可能靶向β干扰素(interferon-β,IFN-β)分子的miRNA,后经RT-qPCR验证发现当用poly(I:C)处理或NDV感染HeLa细胞,分别过表达这25个miRNA,过表达其中3个miRNA(miR-1273f,miR-1184,miR-198)时,IFN-βmRNA和蛋白水平都呈现显著下降趋势。荧光素酶报告系统检测发现当miRNA mimics与含IFN-β3’UTR荧光载体共转染H293T细胞时,荧光强度显著下降,暗示这三个miRNA可能直接靶向IFN-β3’UTR。后期发现这三个miRNA不仅能影响干扰素刺激基因(IFN stimulated genes,ISGs)的转录如干扰素刺激基因15(Interferon-stimulated gene 15,ISG15),干扰素刺激基因56(Interferon-stimulated gene 56,ISG56),抗粘病毒抗性蛋白(antiviral myxovirus resistance protein 1,Mx1),寡腺苷酸合成酶1(the oligoadenylate synthetase 1,OAS1),还能增强NDV NP mRNA转录与NP蛋白翻译,此外模拟外泌体携带这些miRNA的过程中发现,携带有miRNA的外泌体在NDV感染中能增强噬斑在DF-1细胞上形成,暗示其能促进NDV扩散。综上,我们以NDV感染HeLa细胞,经系列实验发现三个通过直接靶向IFN-β影响NDV复制的miRNAs(miR-1273f,miR-1184,miR-198),我们首次验证了外泌体能促进NDV感染HeLa细胞,并通过携带宿主miRNA作用于邻近细胞,提高邻近细胞对NDV的易感性,从而实现促病毒感染,说明携带有利于病毒复制的miRNA的外泌体可能是促进NDV感染的新途径。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

颗粒形态,透射电子显微镜,体形

学位论文第二章 NDV 感染 H HeLa 细胞来源的外泌体形态结构精细，只能通过电镜观察。因此我们分别从感染 ND了外泌体囊泡，经透射电子显微镜观察发现，感染 NDV一些直径大小约在 100 nm 的颗粒，这与正好处于外泌体结构，且外膜具有明显的月牙形态，与外泌体经典“茶杯，这两种状态中的外泌体颗粒形态上差异不明显，但肉可能较未被感染的 HeLa 细胞分泌数量更多的外泌体，

粒径,浓度,细胞外,样品

图 2 外泌体表面标志蛋白 CD63 的鉴定Figure 2. Identification of exosomal surface marker protein CD632.3.3 NTA 检测 HeLa 细胞来源的外泌体大小与分布用纳米颗粒跟踪分析仪 zetaview PMX 110 检测发现，未感染病毒的 HeLa 细胞外泌体样品中颗粒平均大小为 127.9 nm，其中 125.9 nm 大小的颗粒占该样品的 99.3%，感染 NDV 的 HeLa 细胞外泌体样品中颗粒平均大小为 129.2 nm，其中 125.9 nm 大小的颗粒也占样品的 99.3%（如图 3所示）。这些结果与电镜观察到的颗粒大小相吻合，这进一步证明了所提样品为外泌体。同时，NTA 检测发现未感染病毒与感染 NDV 的 HeLa 细胞外泌体样品中颗粒浓度分别为 1.0E+11particles/mL 和 2.5E+11 particles/mL（如图 3 所示），后者浓度约为前者的 4 倍，这可能是由于 NDV感染增强了 HeLa 细胞分泌外泌体的能力。

【参考文献】