玉米赤霉烯酮对TM3细胞microRNA的表达及其致凋亡机制的初步研究

发布时间：2020-06-28 00:04

【摘要】：背景:玉米赤霉烯酮(ZEA)是一种具有雌激素活性的真菌毒素,主要作用于动物生殖系统,可导致家畜繁殖障碍,对农业和畜牧业造成严重损失;microRNA(miRNA)是真核生物体内一段18-26bp的非编码核苷酸片段,miRNA与机体的发育和生理学过程有着密切联系。目的:本研究主要阐明miRNA是否参与ZEA在生殖细胞中毒理学的调控,并验证ZEA是否通过PI3K/AKT通路引起生殖细胞凋亡。方法:通过CCK-8试剂盒检测ZEA对小鼠睾丸间质细胞的最佳染毒浓度并计算半数致死浓度,建立ZEA对小鼠睾丸间质细胞的细胞染毒模型。通过TUNEL检测ZEA对小鼠睾丸间质细胞的凋亡情况。分别提取空白组和ZEA染毒组的RNA,每组3个重复后进行miRNA测序筛选差异表达的miRNA。通过RT-PCR验证miRNA测序结果。miRNA测序筛选出的PI3K/AKT信号通路通过构建腺病毒载体干扰PTEN基因验证ZEA是否通过PI3K/AKT通路促进小鼠睾丸间质细胞的凋亡,流式细胞术验证小鼠睾丸细胞的凋亡情况。Western-blot验证PI3K/AKT通路中PTEN、AKT、p-AKT、Bax、Bcl-2蛋白的变化。结果:1.CCK-8试剂盒显示随着ZEA浓度的提高,小鼠睾丸间质细胞的生长受到抑制,通过计算得出ZEA对小鼠睾丸间质细胞的半数致死浓度为IC_(50)=53.33μmol/L。TUNEL的结果显示当以53.33μmol/LZEA处理小鼠睾丸间质细胞24小时后,小鼠睾丸间质细胞发生明显的凋亡。2.miRNA测序结果显示ZEA处理组和对照组相比,有197个miRNA显著变化(p0.05),其中86个上调,111个下调。通过生物信息学对差异表达的miRNA进行靶基因预测并进行GO和KEGG分析,筛选出了16个与ZEA毒理学相关的miRNA并绘制miRNA-靶基因-信号通路互作图。miRNA-靶基因-信号通路互作图表明Ras信号通路,Rap1信号通路,PI3K-AKT信号通路,Foxo信号通路,AMPK信号通路和MAPK信号通路等通路与ZEA毒理学关系密切。之后通过RT—PCR验证miRNA和靶基因,其结果与测序结果一致。3.构建腺病毒载体后,倒置荧光显微镜观察携带GFP荧光增强标签的腺病毒转染情况,判断最适的multiplicity of infection(MOI)为50MOI。Western-blot结果显示腺病毒有效的干扰了PTEN蛋白的表达。流失细胞术的结果表明小鼠睾丸间质细胞中的PTEN蛋白沉默后可抑制ZEA诱导的凋亡。ZEA组的PTEN、Bax蛋白和空白组相比显著上调(p0.01)。ZEA组的AKT,p-AKT,Bcl-2蛋白和空白组相比显著下调(p0.05)。NC+ZEA组和ZEA组蛋白表达基本一致。shRNA+ZEA组的PTEN、Bax蛋白和ZEA组相比显著下调(p0.05),shRNA+ZEA组的AKT,p-AKT,Bcl-2蛋白和ZEA组相比显著下调(p0.05)。结论:1、ZEA可以起小鼠睾丸间质细胞的凋亡。ZEA对小鼠睾丸间质细胞的半数抑制浓度为IC_(50)=53.33μmol/L。2、ZEA染毒后TM3 Leydig细胞后有16个miRNA与ZEA的毒理学相关。GO富集分析和途径相互作用分析表明,miRNA和靶基因与ZEN的毒理机制关系密切的通路有:Ras信号通路,Rap1信号通路,PI3K-AKT信号通路,Foxo信号通路,AMPK信号通路和MAPK信号通路等。3、ZEA可能通过对PI3K/AKT信号通路诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡。PTEN蛋白可能是ZEA作用于PI3K/AKT信号通路中一个重要靶点。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S859.8
【图文】：

分子结构图,玉米赤霉烯酮,分子结构

1.1.1 ZEA的理化性质玉米赤霉烯酮化学名为6-（10-羟基-6-氧代-1-十一碳烯基）-β-雷锁酸内脂，分子量为318.364g/mol，其结构如图1-1所示(Zinedine et al, 2007; Dellafiora et al, 2017)。ZEA是一种弱极性低分子量化合物，呈白色晶体形式。在长激发波长（360 nm）处呈现蓝绿色荧光，在短波长辐射（260 nm）下呈现更强烈的绿色荧光。对紫外线辐射的最大吸收出现在236nm，274nm 和 316nm。在照射314nm紫外光辐射并在450nm紫外光辐射后，乙醇中的ZEA发生最大荧光。ZEA在水中的溶解度为0.002g / 100ml，熔点为164-165℃。它在储存期间表现出稳定性，并且在暴露于高温时不会降解，也不会被巴氏杀菌过程破坏。然而，它在紫外线辐射和碱性环境的影响下会被降解(Kowalska et al

玉米赤霉烯酮,间质细胞,存活率,成活率

2.3 结果分析2.3.1 ZEA对TM3细胞相对成活率的检测结果如图2-1所示，玉米赤霉烯酮对细胞染毒处理24h后，对细胞产生明显的毒性作用，且随着玉米赤霉烯酮浓度的增加，TM3细胞的相对成活率逐渐降低，与空白组相比，在浓度为30μmol/L时，就会导致细胞成活率极显著降低（P<0.01），通过Graphpad prism分析玉米赤霉烯酮对小鼠睾丸间质细胞的半数抑制浓度IC50为53.33μmol/L。图 2-1 玉米赤霉烯酮对小鼠睾丸间质细胞相对存活率的影响。图中“**”，“*”

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