布鲁氏菌外膜蛋白Omp25对巨噬细胞产生TNF-α的调控作用及机制研究

发布时间：2020-06-28 01:03

【摘要】：布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)感染导致的人畜共患传染病。临床上主要表现为流产、死胎、睾丸炎、关节痛等症状,对畜牧业生产造成巨大的经济损失,同时严重威胁人类健康。巨噬细胞作为机体防御病原入侵和向免疫系统呈递病原信息的细胞,是布鲁氏菌侵染的主要靶细胞。布鲁氏菌在感染宿主的过程中,细菌的外膜蛋白首先与巨噬细胞发生互作完成侵染过程,通过逃避机体免疫,在细胞中存活和繁殖,导致疾病的发生。Omp25作为重要的毒力因子,在布鲁氏菌感染致病过程中起着至关重要的作用。有研究报道,TNF-α作为免疫反应重要的细胞因子,能够有效地对抗机体布鲁氏菌感染,布鲁氏菌感染可抑制巨噬细胞TNF-α的产生,但Omp25对巨噬细胞TNF-α的产生是否有作用,其作用机制如何尚不明确。本研究拟以灭活的猪种布鲁氏菌为模板,构建Omp25和Omp31慢病毒表达载体,完成慢病毒的包装和浓缩。然后,MTT确定慢病毒感染巨噬细胞的最佳浓度和时间,流式细胞术、Q-PCR检测Omp25和Omp31对巨噬细胞周期和凋亡的影响。ELISA检测Omp25对巨噬细胞产生TNF-α的影响,双荧光素酶、Q-PCR和western blotting确定参与调控TNF-α产生的miRNAs和参与调控TNF-α产生的关键信号通路。最后,明确Omp25对巨噬细胞TNF-α产生的信号通路和miRNA的调控机制。研究结果将阐明Omp25对巨噬细胞TNF-α产生的调控作用和机制,为进一步探讨布鲁氏菌逃避宿主免疫反应的机制提供理论依据。研究取得如下结果。1.PCR克隆Omp25和Omp31编码基因,BamH I和EcoR I双酶切后连接转化Stabl3感受态细胞,经鉴定和测序分析,筛选获得正确的重组慢病毒表达质粒pCDH-CMV-omp25-Flag-EF1-copGFP和pCDH-CMV-omp31-Flag-EF1-copGF。将慢病毒表达质粒、被膜质粒PMD2.G和骨架质粒psPAX2共同转染HEK-293T细胞,分别获得Omp25和Omp31慢病毒(Lv-Omp25和Lv-Omp31),RT-PCR和western blotting检测显示慢病毒表达大小约为26 kDa Omp25和30 kDa Omp31。2.以不同浓度梯度和时间梯度的慢病毒感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs),MTT结果显示,Lv-Omp25和Lv-Omp31感染对猪肺泡巨噬细胞活性没有影响(p0.05),当慢病毒以100 MOI浓度感染36 h时,显微镜观察Omp25和Omp31在PAMs中均有表达,且对细胞生长活性无显著影响(p0.05)。流式细胞术检测细胞周期结果显示,与Lv-Blank相比,Lv-Omp25和Lv-Omp31感染后细胞G0/G1、S以及G2/M期均未见显著差异(p0.05)。流式细胞术检测细胞凋亡的结果显示,Lv-Blank、Lv-Omp25和Lv-Omp31感染后巨噬细胞的凋亡率分别是10.3%、9.1%和10.3%,差异不显著(p0.05)。3.Lv-Blank、Lv-Omp25和Lv-Omp31分别感染PAMs和RAW264.7,western blotting结果显示,Omp25和Omp31能够稳定表达;ELISA和Q-PCR检测显示,相比于Lv-Blank和Lv-Omp31,Lv-Omp25可以显著下调LPS诱导的TNF-α、IL-12p40和IL-6表达(p0.01),但对IL-1β没有显著作用(p0.05),同时双荧光素酶活性检测显示,Lv-Omp25可以显著下调LPS诱导的TNF-α启动子活性(p0.01)。4.Lv-Blank和Lv-Omp25分别感染PAMs和RAW264.7,Q-PCR检测显示,Omp25上调miR-130a-3p、miR-146a、miR-181a、miR-181b、miR-301a-3p和miR-351-5p的水平(p0.05,p0.01)。转染不同miRNAs mimics,ELISA和Q-PCR检测显示,miR-130a-3p、miR-146a、miR-181a、miR-181b和miR-301a-3p显著降低了LPS诱导的TNF-α产生,miR-146a和miR-351-5p参与抑制TNF-α转录;western blotting检测结果显示,miR-146a mimics和miR-351-5p mimics显著抑制TRAF6和IRAK1的表达(p0.05)。Lv-Blank和Lv-Omp25感染PAMs和RAW264.7,western blotting检测结果发现,Lv-Omp25感染的细胞TRAF6和IRAK1表达减少,而转染miR-146a和miR-351-5p抑制剂则可上调TRAF6和IRAK1的表达;Q-PCR检测显示,miR-146a和miR-351-5p抑制剂都可上调TNF-α的转录水平(p0.05)。上述miRNA特异抑制剂转染PAMs和RAW264.7后用Lv-Blank和Lv-Omp25感染细胞,ELISA检测显示,相对于非特异性miRNA抑制剂转染细胞,特异性miRNA抑制剂转染的细胞中TNF-α的产生水平显著提高,同时miRNA特异性抑制剂混合转染可使TNF-α的表达水平基本恢复到对照组水平(p0.05)。5.Lv-Blank和Lv-Omp25感染PAMs和RAW264.7发现,Lv-Omp25感染可抑制NF-κB转录活性,同时Lv-Omp25能够减少胞核中p65和胞质p-IκB的表达(p0.05,p0.01),而对p50和IκB的表达没有影响(p0.05)。miR-146a和miR-351-5p抑制剂转染Lv-Omp25感染的细胞结果发现,在PAMs中miR-146a抑制剂显著增加p-IκB的水平;在RAW264.7细胞中,miR-146a和miR-351-5p抑制剂都能增加p-IκB的水平,而对IκB表达没有影响。Lv-Omp25感染可增加JAK-2和SOCS1的表达,降低SOCS3的表达,同时降低p-STAT1的水平和上调p-STAT3的水平,而不影响JAK-1和JAK-3的表达。用JAK2-STAT3信号通路抑制剂处理Lv-Blank和Lv-Omp25感染的PAMs和RAW264.7,结果显示,抑制JAK2-STAT3信号通路可显著地抑制Lv-Omp25感染对TNF-α表达的抑制作用;此外,AG490可显著抑制细胞Lv-Omp25诱导的miR-146a和miR-181a-5p水平,而对miR-130a-3p、miR-301a-3p和miR-351-5p的水平没有影响。本研究成功构建了表达Omp25和Omp31的慢病毒表达载体,获得高滴度慢病毒。用包装的慢病毒成功感染PAMs,并能稳定表达Omp25和Omp31。Omp25和Omp31不参与调节巨噬细胞周期调控和诱导细胞凋亡的发生。Omp25可显著降低PAMs和RAW264.7 TNF-α、IL-12p40和IL-6的表达,且Omp25可抑制TNF-α启动子的活性,而Omp31没有此作用。Omp25可上调与TNF-α抑制有关的miR-130a-3p、miR-146a、miR-181a、miR-301a-3p和miR-351-5p的水平。其中miR-130a-3p、miR-181a和miR-301a-3p通过靶向TNF-α3'UTR直接抑制TNF-α的表达,而miR-146a和miR-351-5p通过直接靶向TRAF6和IRAK1蛋白,进而抑制TNF-α的转录。Omp25可通过上调miR-146a和miR-351-5p抑制NF-κB信号通路的活化,同时通过激活JAK2-STAT3信号通路上调miR-146a和miR-181a-5p进而抑制TNF-α的表达。上述研究结果阐明了布鲁氏菌Omp25抑制巨噬细胞TNF-α产生的作用和调控机制,为更深入探讨布鲁氏菌逃避宿主免疫的机理奠定了基础。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4
【图文】：

图 2-1 PCR 扩增布鲁氏菌 omp25 和 omp31A：omp25 PCR 扩增条带；B：omp31 PCR 扩增条带Fig. 2-1 Production of omp25 and omp31 PCRA: Production of omp25 PCR; B: Production of omp31 PC表达质粒的鉴定 重 组 慢 病 毒 表 达 质 粒 pCDH-CMV-omp25-Fl1-Flag-EF1-copGFP，分别得到了大小约为 666 bp、条带（图 2-2）。阳性质粒送由上海生物工程有限公明重组慢病毒表达质粒 pCDH-CMV-omp25-F1-Flag-EF1-copGFP 均构建成功。

图 2-1 PCR 扩增布鲁氏菌 omp25 和 omp31A：omp25 PCR 扩增条带；B：omp31 PCR 扩增条带。Fig. 2-1 Production of omp25 and omp31 PCRA: Production of omp25 PCR; B: Production of omp31 PCR.表达质粒的鉴定 重 组 慢 病 毒 表 达 质 粒 pCDH-CMV-omp25-Flag-E1-Flag-EF1-copGFP，分别得到了大小约为 666 bp、747条带（图 2-2）。阳性质粒送由上海生物工程有限公司测明重组慢病毒表达质粒 pCDH-CMV-omp25-Flag-E1-Flag-EF1-copGFP 均构建成功。

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 阮静瑶;陈必成;张喜乐;张戎;黄欢捷;;巨噬细胞M1/M2极化的信号通路研究进展[J];免疫学杂志;2015年10期

本文编号：2732349