CIDEC对奶牛乳腺上皮细胞中FASN表达的调控研究

发布时间：2020-06-28 03:44

【摘要】：乳脂是一种高质量的天然脂肪,是牛乳的主要营养成分。乳脂率是衡量牛奶品质优劣的关键指标,也是制约中国奶业发展的重要因素。近年来,奶牛的产奶量日益提高,但乳脂率却未见增长。通常情况下牛奶的乳脂率为3%~4%,产奶量与乳脂率之间呈相互制约关系,如何提高乳脂率一直是学者们研究的热点。研究表明日粮营养素可以通过调节基因的表达参与乳脂合成的调节。乙酸(acetate)和β-羟基丁酸(β-hydroxybutyrate,BHBA)是泌乳奶牛乳腺中脂肪酸从头合成的前体物质,体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中添加乙酸和BHBA可以提高细胞内甘油三脂的合成。但乙酸和BHBA调控乳脂合成分子机制的研究还不十分明确。诱导细胞调亡的DFF45样因子C(Cell-death-inducing DNA-fragmentation-factor-like effector c,CIDEC)是一种脂滴表面蛋白,可促进脂肪的储存和脂滴的发育,进而维持机体平衡和能量代谢。实验室前期结果表明CIDEC可以调节奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)中乳脂的合成,但具体调节途径还不明确。脂肪酸从头合成过程主要由脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FASN)催化。为探讨在乙酸和BHBA作用下,CIDEC与FASN表达以及乳脂合成之间的关系,本研究首先利用消化法获取纯化的BMECs,在8 mmol/L乙酸钠和1 mmol/L BHBA作用下,采用Western blot方法研究了乳脂合成前体物调节CIDEC表达的信号通路,结果显示添加8 mmol/L乙酸钠和1mmol/L BHBA能明显上调mTOR信号通路下游分子p-4EBP1和p-P70S6K的表达;降低pAMPKα的表达,提示在奶牛乳腺上皮细胞中,乳脂合成前体物可通过激活mTOR信号通路和AMPK信号通路调节CIDEC的表达。随后我们采用基因干扰和过表达的方法研究在乳脂合成前体物刺激下,CIDEC对FASN表达及乳脂合成的影响,结果显示CIDEC基因过表达后,奶牛乳腺上皮细胞中FASN蛋白水平和mRNA水平的表达显著升高(p0.01),细胞内TAG含量和脂滴数目增加。CIDEC基因干扰后,FASN蛋白水平和mRNA水平表达显著降低(p0.05),细胞内TAG含量降低,脂滴数目减少。这些结果表明CIDEC能够正向调节FASN的表达,进而影响乳腺上皮细胞中乳脂合成。为研究CIDEC基因对FASN转录水平的调节,我们首先对FASN启动子区转录因子结合位点预测,发现在FASN启动子区存在潜在的C/EBPβ结合位点。采用基因干扰和过表达技术研究C/EBPβ对FASN表达及乳脂合成的影响,结果显示C/EBPβ基因过表达后,奶牛乳腺上皮细胞中FASN mRNA和蛋白水平的表达显著升高(p0.01),细胞内TAG含量增加。C/EBPβ基因干扰后,细胞内FASN mRNA和蛋白水平表达显著降低(p0.01),细胞内TAG含量降低。这些结果进一步证明C/EBPβ对FASN的转录具有正向调节作用,进而影响乳脂合成。随后我们采用双荧光素酶报告基因系统和点突变的方法对FASN启动子区C/EBPβ的结合位点进行验证,结果显示C/EBPβ结合的FASN启动子区域在-110 bp~-50 bp区段。最后为研究CIDEC是否通过C/EBPβ调节FASN的转录,我们采用转染技术在奶牛乳腺上皮细胞中过表达CIDEC,同时干扰C/EBPβ的表达。TAG含量测定显示奶牛乳腺上皮细胞中干扰C/EBPβ的表达可以降低由CIDEC过表达诱导的乳脂合成;qPCR结果也显示干扰C/EBPβ的表达会降低由CIDEC过表达诱导的FASN mRNA的表达水平。综合以上结果,在奶牛乳腺上皮细胞中,CIDEC可以通过与C/EBPβ作用,调节FASN的转录,进而影响乳脂的合成过程。该研究结果可以丰富泌乳奶牛乳腺中乳脂合成的分子机理,为通过分子手段提高奶牛养殖的经济效益提供有价值的实验基础和理论依据。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823
【图文】：

信号途径

的发育、分化和增殖都是十分重要的。节乳脂合成的信号转导通路脂合成的过程中，大量的基因要参与进来，其特点是复杂且动态性强。而相互作用机理，可使人们更好地掌握人工调控乳脂合成。哺乳动物雷帕霉mmalian target of rapamycin，mTOR）信号通路[55]，在众多的信号通路中起[38]。mTOR 是一个高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，属于 PIKK 超家族[54]。其他蛋白结合，形成两个复合体，即 mTORC1（mTOR complex 1）和 mTOR2）。这两种复合物之间的关键差异之一是：mTOR 在 mTORC1 和 mTOR raptor和蛋白质rictor相结合[55-56]。mTORC1复合体包括RAPTOR、mLST8这种复合体可以调节细胞新陈代谢[57]。研究表明，mTOR 在细胞增殖、分、蛋白质的合成和基因的转录过程中伴有重要角色[58-59]。许多研究 mTOR 信号通路与脂质代谢的关系，都集中在非反刍动物和各种报道了 mTOR对奶牛乳腺上皮细胞增殖和乳脂合成具有的调控作用[60-61可以感知营养和生长因子信号，参与乳脂合成在内的合成代谢的调节[62-6明，mTORC1 的激活可以提高 PPARγ 和 C/EBPα mRNA 和蛋白水平的表成相关基因的表达[64-65]。在小鼠中抑制 mTORC1 活性，可削弱脂肪生成

流程图,脂类,抽提,流程图

图 2-1 脂类抽提流程图Fig.2-1 The flow chart of lipid extraction（2）TAG 含量检测[72]1）将 TAG 试剂盒中 4 倍 T1 和 1 倍 T2 进行混匀，制备工作液。2）用蒸馏水将标准品浓度稀释为 15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000、2000 μM3）分别将工作液与蒸馏水，标准品和待测样品进行混匀。4）37℃摇床慢摇 15 min，将待测样品置于波长为 550 nm 的酶标仪中检测。5）读取实验数值，并制作出相应的标准曲线。6）从标准曲线上可查找待测样品中 TAG 含量。.3.2 mTOR 信号通路对 CIDEC 表达的影响在奶牛乳腺上皮细胞中加入一定浓度比列脂类合成前体物质（浓度同 2.3.1），培养细8 h 后，采用 Western blot 方法检测奶牛乳腺上皮细胞中 FASN、ACC、CIDEC、mTOR 磷及 mTORC1 下游信号分子的表达。除 β-actin（内参）抗体为鼠源，1：200 稀释。其他抗为兔源，1：1000 稀释。Western blot 实验步骤如下：（1）奶牛乳腺细胞总蛋白提取细胞处理方法同 2.3.1。48 h 后收集细胞，提取细胞总蛋白。具体实验步骤如下：

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