2型猪链球菌无毒株的分离鉴定与比较基因组学研究

发布时间：2020-06-28 03:52

【摘要】：2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,SS2)不仅可以感染仔猪,也可以感染人类,是危害养猪业及其从业相关人员的重要的人畜共患病病原体。猪链球菌病已经出现40多年了,但是到目前为止仍不断有新的感染病例出现,且在东南亚等国,该疾病的流行趋势没有减弱。中国曾经爆发了两次大规模的人感染猪链球菌的群体公共卫生事件,且多数患者因细菌感染而引发了中毒性休克综合征(streptococcal toxic shock syndrome,STSS),从而无法扭转病程,最终62.7%~81.3%的患者死亡。本课题组密切关注这两次突发感染事件,从中分离到了导致这两次疾病流行的高致病性2型猪链球菌,S.suis 98HAH12和S.suis 05ZYH33,并对其进行了详细的生物学特性研究和基因组学特性分析。其中,我们确定高致病性2型猪链球菌所特有的一个大小约为89 kb的致病岛(89K pathogenicity island,89K PAI),是导致这两次疾病流行致死率较高的主要原因,且89K PAI上含有毒力因子(virulence-associated factor,VAF)、二元信号转导系统(two-component signal transduction system,TCSTS)和四型分泌系统(type IV secretion system,T4SS)等与细菌致病性密切相关的基因元件。已鉴定出的猪链球菌的毒力因子有20多个,其中最主要的是荚膜多糖(capsular polysaccharides,CPS)和猪链球菌溶血素(suilysin,SLY),CPS不仅可以为细菌提供保护屏障,还参与细菌对宿主细胞的抗吞噬能力;SLY可以增加细菌密度,促进细菌引发宿主炎症反应。其他毒力因子也参与到细菌与宿主的相互作用和促进细菌透过宿主的血脑屏障等。但是,猪链球菌毒力的来源及分化尚不清楚,寻找有效的预防手段是防治猪链球菌病的长远目标。因此本课题以从流行区猪群中分离到的一株不致病的2型猪链球菌为研究基础,通过对其进行生物学特性鉴定、全基因组测序和比较基因组学分析,探讨猪链球菌各菌株之间毒力演化和基因组重排的方式,探索可以预防该疾病的疫苗。主要研究内容和实验结果如下:1.2型猪链球菌05HAS68生物学特性的鉴定:分别对细菌进行培养观察和革兰染色,用分光光度计法测定细菌的溶血活性,列举活菌数目测定细菌的全血存活能力。用流式细胞仪测定细菌对Hep-2细胞的粘附能力,用梅里埃生化检测卡鉴定细菌的生化反应类型。通过以上实验我们确定S.suis 05HAS68与高致病性菌株S.suis 05ZYH33相比,是一株具有较高粘附能力但溶血活性较差的血清2型猪链球菌。进一步利用16S r RNA基因分型和多位点序列分型,证明该菌株属于猪链球菌属,ST28型。2.2型猪链球菌05HAS68全基因组测序及全基因组注释:利用二代测序技术Ion torrent PGM测序仪,分别构建待测基因组的测序文库,其中Mate-pair 4 kb库和shotgun小片段随机库分别达到127×和114×的测序覆盖度。采用Newbler v2.8和CLC Genomics Workbench对测序reads进行拼接后得到S.suis 05HAS68的全基因组序列长度为2,176,073 bp。通过RAST在线注释和比对BLAST、COG、KEGG数据库对S.suis05HAS68进行全基因组注释。利用DNAStar软件包、CGView Server、t RNAScan-SE 1.21和RNAmmer 1.2,分析S.suis 05HAS68基因组的一般特性。注释及分析结果显示,S.suis 05HAS68基因组的GC含量为41.2%,共编码2009个基因,另外还编码56个t RNA基因和12个r RNA基因。3.2型猪链球菌05HAS68与有毒株的比较基因组学分析:采用比对毒力因子数据库和BLASTp比对的方法,鉴定S.suis 05HAS68基因组上存在的VAF和TCSTS。通过Island Viewer、CRISPRfinder和Prophage Finder鉴定S.suis 05HAS68基因组上可能的基因组岛、CRISPR结构和前噬菌体结构。利用ACT和Mauve软件分析S.suis05HAS68与其他猪链球菌基因组大规模重排的方式和规律。我们发现S.suis 05HAS68与S.suis 05ZYH33和S.suis 98HAH12共有1751个基因,但是S.suis 05HAS68特有253个基因。其中包括1个CRISPR结构、4个前噬菌体结构和1个113K代谢岛(半乳糖代谢途径和岩藻糖代谢途径)。S.suis 05HAS68基因组中缺少重要的VAF,例如SLY、MRP、EPF和毒力相关蛋白E等,Sal K/Sal R、Nis K/Nis R、Vir R/Vir S和Rev S等毒力相关的TCSTS在S.suis 05HAS68基因组中也是缺失的。S.suis 05HAS68基因组与其他猪链球菌基因组之间存在由转座酶和前噬菌体介导的大规模基因组重排,且重排围绕基因组的复制轴(ori/ter axis)呈“X形”。4.89K PAI在S.suis各菌株中的分布情况及S.suis的系统发生分析:比对89K PAI序列在猪链球菌以及其他链球菌中的分布情况。在猪链球菌P1/7、A7、GZ1、S735、ST1和ST3菌株中没有比对到89K PAI的同源序列,在猪链球菌SC84和BM407中比对到了绝大部分的89K PAI同源序列,其他猪链球菌中则比对到了一部分89K PAI同源片段,另外在无乳链球菌和肺炎链球菌中也比对到了部分89K PAI的同源序列。综合评价用rpo B、16S r RNA、ITS(internal transcribed spacer)和core gene构建的系统发生树,可以看出S.suis 05HAS68在进化关系上与高致病性2型猪链球菌相距较远。5.2型猪链球菌05HAS68的毒力鉴定及免疫保护初探讨:用同等剂量(1×108 CFU)的S.suis 05HAS68、高致病性菌株05ZYH33和98HAH12分别攻击仔猪。攻毒实验证明,S.suis 05HAS68对动物不具有致死性。分别用无毒株05HAS68和基因敲除改造的无毒株Δsal KR免疫仔猪2次后,再用高致病性菌株05ZYH33或98HAH12进行攻击,观察无毒株05HAS68对仔猪是否具有免疫保护作用。实验结果显示,事先用无毒株05HAS68免疫的动物可免受高致病性菌株的攻击,但是用基因敲除改造的无毒株Δsal KR免疫的仔猪,不能抵抗高致病性菌株05ZYH33的攻击,初步说明S.suis05HAS68对仔猪具有免疫保护效果。综上所述,本研究成功的鉴定了一株无毒的2型猪链球菌05HAS68,并对其进行全基因组测序和比较基因组学分析。研究发现,S.suis 05HAS68与高致病性猪链球菌之间存在较大的毒力差异,且基因组间存在大规模重排,可能是由转座酶和/或前噬菌体介导的。该无毒株有望成为预防猪链球菌病的疫苗候选株。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.611

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 王继春,何家惠,侯继波,徐筠遐,刘冬霞,褚长贵,王伟峰,刘跃兴,杨英;猪链球菌2型与马链球菌兽疫亚种生物学特性的初步比较[J];中国预防兽医学报;2000年S1期

2 朱凤才,杨华富,胡晓抒,汪华,王广和,宋亚军,杨瑞馥;人源和猪源猪链球菌的同源性研究[J];中华流行病学杂志;2000年06期

3 唐文渊 ,Zygmunt Pejsak;猪链球菌是一种条件性病原菌[J];国外畜牧学(猪与禽);2005年04期

4 查红波;2型猪链球菌研究进展[J];江西饲料;2005年04期

5 许青华;重新认识猪链球菌[J];畜牧兽医科技信息;2005年09期

6 刘华;喻华;周忠华;颜英俊;黄文方;;致生猪疫情的猪链球菌检测结果分析[J];中华检验医学杂志;2006年01期

7 崔正瀛;李学瑞;柳纪省;;2型猪链球菌的分子生物学研究进展[J];中国畜牧兽医文摘;2006年03期

8 白昀;覃伦;龙剑明;熊毅;覃芳芸;朱伟;郭建刚;李华明;刘棋;;猪链球菌9型的分离与鉴定[J];上海畜牧兽医通讯;2007年01期

9 王福贵;龙忠臣;王海鹏;;临床分离猪链球菌的药物敏感性分析[J];黑龙江畜牧兽医;2007年06期

10 覃芳芸;陈磊;潘杰;熊毅;白昀;朱伟;郭建刚;李华明;刘棋;;猪链球菌1型的分离与鉴定[J];黑龙江畜牧兽医;2007年09期

相关会议论文 前10条

1 聂小想;崔言顺;沈志强;管宇;逄媛;刘吉山;王艳;;20株猪链球菌核糖体基因多态性的研究[A];首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集（2008）[C];2008年

2 刘梅芬;吴志明;闫若潜;盛敏;赵明军;拜廷阳;;猪链球菌种与9型猪链球菌二重PCR检测方法的建立及应用[A];中国畜牧兽医学会小动物医学分会第四次学术研讨会、中国畜牧兽医学会兽医外科学分会第十六次学术研讨会论文集（2）[C];2009年

3 刘梅芬;吴志明;闫若潜;盛敏;赵明军;拜廷阳;;猪链球菌种与9型猪链球菌二重PCR检测方法的建立及应用[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集（下册）[C];2009年

4 张安定;朱伟峰;胡攀;金梅林;;猪链球菌分子流行病学研究[A];第三届全国微生物资源学术暨国家微生物资源平台运行服务研讨会会议论文摘要集[C];2011年

5 何孔旺;倪艳秀;王继春;何家惠;王伟峰;杨瑛;陆承平;林继煌;;猪链球菌2型的分子流行病学研究[A];猪的重要传染病防治研究新成果——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第五届理事会第二次全体会议暨防检疫专业委员会第7次学术交流会论文集[C];2002年

6 徐建国;郑翰;叶长芸;景怀琦;;猪链球菌的二阶段致病机理假说[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年

7 熊毅;刘棋;覃芳芸;朱伟;徐贤坤;付薇;;广西猪链球菌2型流行病学研究[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年

8 臧莹安;谢乐新;李家侨;庞木生;李淼;宋帅;李春玲;;表观健康的猪肉携带猪链球菌的调查[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年

9 罗玲;徐涤平;刘泽文;郑浩;汪宏才;;猪链球菌2型的研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会论文集[C];2005年

10 刘春生;徐耀辉;陈陆;杨霞;王新娟;高冬生;王永生;程海卫;刘春明;王川庆;;猪链球菌种及1、2、7型多重PCR检测方法的建立及应用[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会论文集[C];2010年

相关重要报纸文章 前10条

1 记者 曾星;快速猪链球菌检测方法问世[N];中国国门时报;2005年

2 记者 姚雷 张颖;猪链球菌检测将有据可依[N];中国国门时报;2005年

3 雒庆举;可能对“猪链球菌”设险吗[N];中国保险报;2005年

4 井 韦;把四天缩短为四小时[N];中国质量报;2005年

5 菊　文;积极应对猪链球菌2型疫情[N];中国国门时报;2005年

6 记者 何成军 见习记者 钱河山;猪链球菌疫情不足忧[N];甘肃经济日报;2005年

7 郑灵巧;猪链球菌进犯人类告诉我们什么[N];健康报;2005年

8 北京地坛医院主任医师 蔡皓东;猪链球菌又到人间作孽[N];健康报;2005年

9 记者 原国锋;猪链球菌快速检测方法通过鉴定[N];人民日报;2005年

10 逸闻;猪链球菌序列变异导致毒力增加[N];中国畜牧兽医报;2006年

相关博士学位论文 前10条

1 姚新月;2型猪链球菌无毒株的分离鉴定与比较基因组学研究[D];第三军医大学;2015年

2 魏子贡;猪链球菌流行病学及其生物被膜形成机理研究[D];华中农业大学;2010年

3 李学瑞;猪链球菌防治新技术研究[D];中国农业科学院;2011年

4 吴全忠;猪链球菌2型在模型动物豚鼠体内的动态分布及基因免疫[D];南京农业大学;2001年

5 欧瑜;猪链球菌2型毒力相关蛋白的检测及其基因片段的克隆与表达[D];南京农业大学;2001年

6 陈国强;猪链球菌2型检测方法的研究及其在出入境检疫中的应用[D];南京农业大学;2011年

7 王淑杰;东北三省猪场S suis感染状况调查及S.suis7比较蛋白组学研究[D];东北农业大学;2013年

8 路玲玲;利用插入失活法对2型猪链球菌毒力因子的研究[D];中国疾病预防控制中心;2008年

9 刘曼莉;猪链球菌2型感染宿主后宿主表达谱的分析研究[D];华中农业大学;2011年

10 郑霄;基于芯片的猪链球菌比较基因组学研究[D];中国疾病预防控制中心;2011年

相关硕士学位论文 前10条

1 李晓云;东北地区猪链球菌对大环内酯类抗生素耐药机制研究[D];东北农业大学;2009年

2 赵焕灿;浙江省猪链球菌血清及分子流行病学调查[D];浙江大学;2010年

3 张静;猪链球菌二氢硫辛酰胺脱氢酶的生物学功能初探及串联蛋白的免疫保护评价[D];上海交通大学;2012年

4 岳修伟;上海部分地区猪链球菌2型流行病学调查及其耐药性研究[D];上海交通大学;2013年

5 覃芳芸;广西猪链球菌2型流行病学研究[D];广西大学;2008年

6 郭培元;猪链球菌2型的分离鉴定以及实验性感染猪链球菌2型的病理学研究[D];扬州大学;2008年

7 夏静;猪链球菌2型及其毒力相关因子对细胞的吸附和毒性作用的研究[D];华中农业大学;2008年

8 康超;感染猪链球菌2型后细胞因子的变化以及分泌核酸酶A的生物学研究[D];华中农业大学;2008年

9 姜艳华;猪链球菌不同血清型抗血清的制备及在病原流行病学调查中的应用[D];南京农业大学;2008年

10 李兆龙;应用增强型绿色荧光蛋白标记猪链球菌2型及实时定量PCR分析其体内感染动态[D];南京农业大学;2008年

本文编号：2732518