猪圆环病毒3型全基因组克隆及荧光定量PCR方法的建立与应用

发布时间：2020-06-28 18:54

【摘要】：猪圆环病毒3型(PCV3)是一种新型猪圆环病毒,于2016年首次发现,流行病学调查发现PCV3经常感染患有PDNS和繁殖障碍症状的猪群,由于猪圆环病毒3型已在世界上流行,因此快速准确地诊断猪群的感染状态对于预防和控制该疾病具有非常重要的意义。本文利用PCR扩增PCV3保守基因片段(152bp),将其克隆到pMD-19T载体上,构建重组质粒pMD19T-PCV2-Cap作为阳性标准品质粒(同时作为两种荧光定量PCR检测方法的标准品质粒),并对其进行敏感性、特异性和重复性验证。结果如下:1.SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR:标准品在4.5×1010～4.5×103拷贝/μ L范围内呈良好的线性关系,其相关系数为0.998,斜率为3.448;特异性强与PRRSV、PCV2、PPV、JEV及PRV均无交叉反应,敏感性为4.5×103拷贝/μL,与常规PCR方法相比高出10倍,组间和组内重复性试验的变异系数均小于2%;采用SYBR Green Ⅰ PCR检测435份猪场血清样品,阳性率为65.7%,高于普通PCR阳性检测率的51.7%,表明建立的PCV3 SYBR Green Ⅰ PCR方法敏感、特异,可用于猪场PCV3感染的快速检测。因TaqMan具有更好的特异性,本研究建立了基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测方法,并对这批样品进行了检测。2.TaqMan荧光定量PCR:标准品在4.5×1011～4.5×103拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,其相关系数为1,斜率为3.982;特异性强,敏感性为4.5×102拷贝/μL,组间和组内重复性试验的变异系数均小于2%;利用TaqMan荧光定量PCR对435份猪场血清样品进行检测,得出阳性率为70.11%,高于普通PCR阳性检测率的51.7%,说明建立的TaqMan荧光定量PCR方法成功。3.5株PCV3全基因序列分析:通过本研究所建立的荧光定量方法检测吉林省部分猪组织样品,并扩增其全序列,测序鉴定正确后,获得5株PCV3全基因序列。通过遗传进化与核苷酸同源性分析,5株毒株之间的核苷酸同源性为98.7%～99.5%,与国内20株PCV3序列核苷酸同源性为98.7%～100%,与国外10株PCV3序列同源性为98.4%～99.6%。本文所建立的两种荧光定量方法可用于PCV3的检测及流行病学调查,为防治PCV3奠定基础;对PCV3全基因组进行扩增,并进行相应分析,为PCV3的流行趋势研究提供一定的依据。
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.28
【图文】：

图１邋ＰＣＶ３基因结构逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋ＰＣＶ３邋ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ逡逑３主要结构蛋白及其功能逡逑要有ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３这三个开放阅读框组成；ＯＲＦ，在动物机体内，可诱导其发生特异性免疫应答反应。Ｏ；当下对ＯＲＦ３的功能，并没有得出任何结论ＰＣＶ２白同源性较低，这也就可以说明了其两者间出现交叉免的，或者也可以说是两者之间是没有交叉免疫保护性的。逡逑分离逡逑能在原代猪肾细胞、ＢＨＫ－２１细胞等上生长，只能在ＰＫ－１。逡逑３诊断方法逡逑３是在患ＰＤＮＳ的母猪以及它的流产胎儿体内检测得到ＰＣＶ３的患病猪其临床症状和病理变化都和ＰＣＶ２引起

对标准品质粒ｐＭＤ］９Ｔ－Ｃａｐ进行１０倍倍比稀释，选择其中的逡逑ＵｘｌＯＨＭ＾Ｈ＾ｃｏｐｉｅｓ／ｐｌ邋进行邋ＳＹＢＲ邋Ｇｒｅｅｎ邋Ｉ邋Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ邋扩增。结果如下图逡逑（图３）显示，标准曲线其斜率为３．４４８，截距为４８．７１８，相关系数为０．９９８。本逡逑研宄所建立的ＳＹＢＲ邋Ｇｒｅｅｎ邋Ｉ邋Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ方法具有较高的扩增效率。阴性未出逡逑现非特异性扩增。溶解曲线只有单一峰值，阴性无峰值。逡逑

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本文编号：2733357