缺氧诱导肉鸡心肌细胞凋亡中Calpains的作用及牛磺酸调控机理的研究

发布时间：2020-06-28 19:01

【摘要】：肉鸡心脏、血液循环系统对氧气的供应满足不了其快速增长的体重需求是肉鸡腹水综合征(AS)发生的主要因素,右心肥大继而衰竭是AS发生及导致肉鸡死亡的重要原因,相关研究表明心肌细胞凋亡在右心肥大继而衰竭中起着重要作用。本课题组前期研究表明,肉鸡饮水添加牛磺酸能有效减少腹水综合征的发病情况,且能降低心肌组织中钙蛋白酶(Calpains)的活性。目的:本试验通过缺氧处理原代肉鸡心肌细胞,采用牛磺酸(Tau)与PD150606(Calpains的一种特异性抑制剂)分别及共同处理的方式,比较探讨牛磺酸抗心肌细胞凋亡的作用是否通过影响Calpains的活性来实现。以期为肉鸡腹水综合症的防治提供理论依据。方法:分离培养12日龄鸡胚心肌细胞,采用细胞免疫化学方法进行纯度鉴定,MTS方法监测心肌细胞活力。待心肌细胞生长稳定进行分组处理:空白对照组(C)、Tau对照组(CT)、PD150606对照组(CP)、Tau加PD150606对照组(CTP)、缺氧模型组(M)、Tau模型组(MT)、PD150606模型组(MP)、Tau加PD150606模型组(MTP)。Tau及PD150606的药物添加浓度分别为10 mmol/L、10 umol/L,预处理时间分别为12 h、0.5 h,缺氧处理时间为12 h。AO/EB检测各组细胞凋亡情况;荧光探针法检测各组心肌细胞内Ca~(2+)浓度;RT-PCR检测Calpain-1、Calpain-2、Caspase-9和Caspase-3的mRNA相对表达量;WB检测Calpain-1、Bcl-2、Cyt-C以及Caspase-9和Caspase-3蛋白相对表达量。试验结果如下:1)肉鸡胚胎心肌细胞的分离培养与鉴定:本试验中采用的心肌细胞分离方法,可稳定获得平均纯度95%、活力97%的肉鸡心肌细胞,试验周期5天内心肌细胞纯度稳定,能满足试验要求。2)Tau对缺氧肉鸡心肌细胞凋亡率的影响:单纯缺氧培养12 h极显著提高了心肌细胞的凋亡率(P0.01),Tau及PD150606预处理都能显著降低缺氧条件下心肌细胞的凋亡率(P0.05),两者共同作用效果更佳(P0.01)。3)Tau对缺氧肉鸡心肌细胞抗氧化能力及细胞损伤的影响:缺氧培养能提高心肌细胞培养上清中以及细胞内的MDA含量(P0.05,P0.05),Tau能减少MDA含量的上升。缺氧能使心肌细胞培养上清中SOD活力较对照组显著提高(P0.05),添加Tau则使上清及胞内SOD活力较M组显著提高(P0.05,P0.05)。PD150606对缺氧肉鸡心肌细胞MDA含量及SOD活力未产生显著影响,显著提高了正常培养的细胞内的MDA含量(P0.05)。缺氧及Tau对心肌细胞LDH活力无显著影响,PD150606可使缺氧条件下的上清LDH活力稍提高(P0.05),可使细胞内LDH活力下降(P0.05)。4)Tau对缺氧肉鸡心肌细胞凋亡相关基因mRNA相对表达量的影响:缺氧使肉鸡心肌细胞Calpain-1、Calpain-2、Caspase-9及Caspasse-3基因的mRNA表达极显著增高(P0.01)。Tau可显著抑制缺氧肉鸡心肌细胞Calpain-1、Calpain-2(P0.05,P0.01),极显著抑制Caspase-9及Caspasse-3基因的mRNA表达增高(P0.01,P0.01)。PD150606对Calpains基因的mRNA表达水平无影响,对Caspase-9的抑制能力极显著低于Tau(P0.01),同时显著增加了Caspase-3 mRNA表达水平(P0.01)。5)Tau对缺氧肉鸡心肌细胞凋亡相关蛋白表达的影响:缺氧使Calpain-1的蛋白表达水平极显著升高(P0.01),Tau及PD150606均能显著抑制Calpain-1表达升高(P0.05),但两者共同作用无抑制效果(P0.05)。缺氧使Bcl-2蛋白相对表达量极显著下降(P0.01),Tau及PD150606能极显著维持Bcl-2蛋白水平(P0.01)。缺氧使心肌细胞Cyt-C蛋白极显著增加(P0.01),Tau能极显著降低缺氧情况下Cyt-C蛋白量(P0.01),PD150606能显著降低缺氧情况下Cyt-C蛋白量(P0.05)。M组Caspase-9蛋白表达极显著高于其他7组(P0.01),Tau及PD150606都能极显著降低其蛋白表达水平(P0.01),Tau效果显著高于PD150606(P0.05)。缺氧极显著降低了M组未剪切Caspase-3的蛋白表达量(P0.01),Tau及PD150606都能显著减少该降低情况(P0.01,P0.05),两者共同作用效果最佳;推测缺氧造成Caspase-3蛋白活化,Tau及PD150606都能极显著减少活化的发生。综上所述,在肉鸡心肌细胞发生缺氧损伤时,预防性应用牛磺酸具有提高心肌细胞抗氧化的能力;并通过调控Calpains的表达显著抑制了Cyt-C介导的细胞凋亡通路中相关因子的基因和蛋白表达,有效抑制了心肌细胞凋亡的发生。因此可以推测:Calpains可通过Cyt-C途径促进缺氧肉鸡心肌细胞凋亡;牛磺酸可通过调控Calpains来实现对缺氧心肌细胞的保护功能,但不局限于该途径。以上研究结果为临床中应用牛磺酸防治肉鸡AS提供了理论依据。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.31
【图文】：

心肌细胞,显微镜下,成纤维细胞,倒置显微镜

图 1 倒置显微镜下不同时期的心肌细胞与成纤维细胞igure 1 Myocardial cells and mechanocytes at differdnt times under inverted microsco 倍显微镜下心肌细胞培养 24 h 的形态，心肌细胞已贴壁，但伸展不充分。 B：100 倍显微镜下心肌细胞培养 48系增加。C：200 倍显微镜下心肌细胞培养 72 h 的细胞形态，可见明显的圆形细胞核。D：200 倍显微镜下 P2 成态，细胞贴壁紧密、立体感差，和区界线不清。E：200 倍显微镜下心肌细胞培养 10 d 的部分细胞状态，黄色箭的心肌细胞及细胞簇。F：200 倍下 14 d 的部分细胞细胞形态，底层成纤维细胞生长挤占上层心肌细胞，心肌细缩脱落。 Myocardial cells were cultured for 24 h. B:100× Myocardial cells were cultured for 48 h. C:200× Myocar h. D:200× The second generation mechanocytes were cultured for 24 h. E:200× Myocardial cells were culturelsate cells. F:200× Myocardial cells were cultured for 14 d.验中曾对 9 到 14 日龄鸡胚进行心肌细胞分离培养试验。结果表明随鸡心脏体积变大，可获得心肌细胞数量增多，但随日龄的增加分离所得

对比图,心肌细胞,成纤维细胞,对比图

图 2 心肌细胞与成纤维细胞对比图Figure 2 The differents between myocardial cells and mechanocytes 倍显微镜下心肌细胞的 α-Sarcomeric actin 一抗阳性鉴定结果。B：200 倍显微镜下用 PBS 代替 α-Sarcomeric ac鉴定结果，其显示大小与 C、D 图一致。C、D：分别为 200 倍显微镜下的 A 图片的放大效果，及放大后负片处

【参考文献】