外泌体在PRRSV感染过程中的作用及其机制研究

发布时间：2020-06-29 15:23

【摘要】：外泌体(Exosomes)是细胞向胞外分泌的一类双层膜包被的囊泡,直径为30-150nm。外泌体可以介导蛋白质或核酸的转运,从而参与多种生理或病理过程。以前的研究发现,某些病毒可以通过外泌体携带其基因组或病毒粒子,从而介导病毒在细胞之间的传递或建立感染。我们前期在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染细胞的分泌蛋白质组学研究时发现,PRRSV感染细胞后外泌体释放途径被激活。同时,国外学者发现,从PRRSV感染猪的血清中提取的外泌体中含有PRRSV部分编码蛋白。但是,外泌体是否能够携带PRRSV基因组RNA或病毒粒子从而介导病毒在细胞之间的扩散尚不清楚。因此,本研究开展了外泌体在PRRSV感染中的作用研究,发现PRRSV感染细胞的外泌体携带病毒的基因组RNA,分泌的外泌体可以建立感染。更重要的是,我们发现外泌体介导的PRRSV感染不能被PRRSV特异性中和抗体中和,是PRRSV逃逸中和抗体作用的一种策略。主要研究内容如下:1.PRRSV感染细胞释放的外泌体(PRRSV-exosome)提取与纯化为了获得无游离PRRSV污染的外泌体,我们先采用PEG沉淀法富集PRRSV感染细胞上清中的外泌体,经超高速离心去除杂蛋白,然后通过CD63磁珠免疫亲和法对提取的外泌体进行纯化。通过Western blot检测、电镜观察和免疫金标记技术对提取的外泌体纯度进行检测。Western blot结果证实提取的外泌体含有外泌体标志蛋白CD9,CD63和Alix,但未检测到内质网标志蛋白GRP94;电镜下观察到提取的外泌体呈典型的囊泡结构,大小为30~150nm;免疫金标记技术能检测到外泌体的标记蛋白Alix,但检测不到PRRSV的病毒粒子蛋白nsp2和GP4。上述检测结果表明提取的外泌体纯度高,且无游离的病毒粒子污染。2.PRRSV-exosome包含病毒成分采用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)对纯化的外泌体进行分析,发现外泌体中含有216种宿主蛋白,大部分是以前报道的外泌体分泌蛋白。同时,我们还发现纯化的外泌体中含有PRRSV的3种结构蛋白(GP5、M和N),用针对这三种结构蛋白的单克隆抗体通过Western blot检测纯化的外泌体,证实这三种结构蛋白确实包含在纯化的外泌体中。进一步通过RT-PCR分析了纯化的外泌体中是否包含PRRSV基因组RNA,将PRRSV的基因组分成5个重叠的片段进行检测,可以成功扩增5个重叠的片段,提示纯化的外泌体中可能含有PRRSV的完整基因组RNA。3.PRRSV-exosome对允许细胞和非允许细胞均具有感染性将纯化的PRRSV-exosome接种PRRSV允许细胞PK-15~(CD163)和Marc-145细胞,通过观察细胞病变、检测病毒蛋白表达和TCID_(50)测定分析PRRSV-exosome是否具有感染性。结果发现,在两种细胞上均能观察到PRRSV所引起的典型细胞病变,间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot均能检测到PRRSV N蛋白表达,TCID_(50)检测证实外泌体感染所获得的病毒滴度与PRRSV感染细胞所获得的病毒滴度无显著差异。进一步将PRRSV-exosome接种PRRSV的非允许细胞PK-15,同样能观察到典型的细胞病变和PRRSV N蛋白的表达,说明PRRSV-exosome在PRRSV允许细胞和非允许细胞上均能建立增殖性感染。4.外泌体释放抑制剂能抑制PRRSV-exosome介导的PRRSV传播采用Transwell system建立PK-15~(CD163)和PK-15细胞的共培养模型,检测在共培养体系中加入外泌体抑制剂GW4869后两种细胞中PRRSV感染与增殖情况。Real-time PCR和Western blot检测发现,加入抑制剂后不影响PK-15~(CD163)细胞中病毒基因组RNA水平和nsp2蛋白表达,而PK-15细胞中病毒RNA水平和nsp2的表达量均显著降低,说明外泌体释放抑制剂能抑制外泌体介导的PRRSV传播,同时也间接证实PRRSV-exosome能在PRRSV非允许细胞上建立增殖性感染。5.PRRSV中和抗体不能阻断PRRSV-exosome介导的PRRSV传播将PRRSV特异性中和抗体处理的PRRSV-exosome和PRRSV分别接种PK-15~(CD163)细胞和Marc-145细胞,IFA和Western blot检测PRRSV N蛋白或nsp2蛋白的表达,结果经中和抗体处理过的PRRSV所接种的细胞中N蛋白和nsp2蛋白表达均显著降低,而中和抗体处理过的PRRSV-exosome接种的细胞中N蛋白和nsp2蛋白表达均无明显变化。进一步采用Transwell system共培养PK-15~(CD163)和Marc-145细胞,通过荧光定量RT-PCR检测中和抗体对PRRSV-exosome感染性的影响,结果与对照相比,两种细胞中PRRSV RNA水平无显著差异,并且在PK-15~(CD163)和原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)的共培养模型中也获得了同样的结果,说明中和抗体不影响PRRSV-exosome介导的PRRSV传播。6.PRRSV N蛋白可通过外泌体途径激活NF-κB信号通路并诱导炎症反应由于PRRSV感染细胞的外泌体含有病毒的N蛋白,而以前的研究证实PRRSV N蛋白具有诱导炎症反应的特性。为了探讨N蛋白是否可以通过外泌体途径介导炎症反应,将N蛋白的真核表达质粒转染HEK-293T细胞并从转染细胞上清中纯化外泌体(N-exosome),Western blot检测证实纯化的外泌体中含有N蛋白。用纯化的外泌体处理PK-15~(CD163)细胞,检测NF-κB的激活和炎症因子表达,发现含有N蛋白的外泌体可激活NF-κB的荧光素酶活性、促进p65的磷酸化和核转运,IL-6、IL-8、TNF-α和RANTES等炎症因子mRNA水平也显著上调,而且在PAM细胞上也观察到同样的结果,说明N-exosome可激活NF-κB信号通路并诱导炎症反应。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.28
【图文】：

1图 1-1 外泌体分泌示意图及电镜图（Colombo M et al 2014）Fig. 1-1 Schematic representation of the different types of membrane vesicles released beukaryotic cells and electron microscopy image of fusion of a MVB with the PM

图 1-2 外泌体生成机制示意图（Kowal J et al 2014） Schematic representation of the origin and release of exosomes by eukar泌体的分子组成

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本文编号：2734027