绵羊BMP2和PDGF-D基因多态性与尾型的关联及细胞水平功能验证
发布时间：2020-06-29 15:39
【摘要】：本课题组前期对国内外绵羊品种进行了全基因组重测序分析,筛选出了一些与绵羊尾型相关的基因,其中BMP2(骨形态发生蛋白2,bone morphogenetic protein 2)和PDGF-D(血小板源性生长因子D,Platelet-derived growth factor-D)受到强烈选择。本试验选择BMP2和PDGF-D作为候选基因,进行分子水平和细胞水平验证,旨在为绵羊尾部脂肪沉积的调控提供基础研究资料,为分子育种提供可用的遗传标记。选取藏羊、湖羊两品种各30个个体的基因组样本分别等量混池,扩增BMP2和PDGF-D所有外显子及基因上下游1000 bp,使用飞行质谱对检测到的SNP位点进行基因分型,利用Haploview 4.1软件进行连锁不平衡分析,使用SAS 9.2软件将多态位点与尾型性状关联分析。同时,从胎羊尾部脂肪组织中分离原代前体脂肪细胞,对其进行培养扩增获得细胞水平验证的原材料。利用慢病毒载体将BMP2和PDGF-D基因稳定过表达于前体脂肪细胞中,用胰岛素进行诱导分化,利用q PCR和WB(Western blot)方法对脂肪细胞分化过程中的标记基因脂蛋白脂酶(LPL)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的表达量进行检测。对成熟脂肪细胞油红O染色观察脂滴形成情况。得到以下结果:1)在BMP2基因下游发现3个突变位点:g.48401619 TA、g.48401272 CA、g.48401136 CT;在PDGF-D基因上游发现1个突变位点:g.3852134 CT,内含子区发现1个位点:g.4122606CG。2)BMP2基因的g.48401619 TA、g.48401272 CA和g.48401136 CT位点与尾长呈显著相关(P0.05);PDGF-D基因的g.4122606 CG位点与尾长显著相关(P0.05),g.3852134 CT位点与尾宽显著相关(P0.05)。3)BMP2基因的g.48401619 TA、g.48401272 CA和g.48401136 CT三个位点中,g.48401272CA和g.48401136 CT之间存在强连锁。构成3种单倍型,6种组合基因型。其中CACT型和CCCT型个体在尾长、尾宽和尾周长上均处于优势,平均值较小,而CCCC型个体尾性状平均值相较于其他基因型较大。4)分离出的绵羊原代前体脂肪细胞呈不规则状或梭型,传代后仍具有较强增殖能力和分化能力。5)BMP2过表达组中,在m RNA水平,PPARγ和LPL的表达量均有上调,PPARγ在第0天和第1天显著高于对照组(P0.05),LPL在第1天和第7天极显著高于对照组(P0.01);蛋白水平各基因差异不明显。BMP2对体外绵羊前体脂肪细胞的分化有促进影响。6)PDGF-D过表达组中,PPARγ和LPL的表达呈显著上调趋势(P0.05),与对照组相比,PPARγ仅在第0天未达到显著水平,LPL仅在第3天未达显著水平。WB结果显示试验组PDGF-D、PPARγ表达量较高。PDGF-D对体外前体脂肪细胞的成脂分化具有显著促进作用。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S826
【图文】：
这是前脂肪细胞分化必经的生长停滞期（GrowthArrest）（Pairaultetal.,19ire et al., 1998）。生长停滞期的细胞接收到成脂信号后，将重新进入细胞周期，进行多次，细胞此时处于有丝分裂克隆扩增期（Mitotic Clonal Expansion）。研究表明在克隆扩增，发生 DNA 的复制和染色体结构变化增加了顺式元件对作用因子的可接近性，这些作活或抑制决定了与脂肪细胞的分化相关基因的表达（Macdougald et al., 1995）。在细胞增殖后，前脂肪细胞会进入一个新的生长抑制期，称之为 GD 期（Scott et al., 1982）。的细胞虽然已经处于终端分化（Terminal Differentiation）的起始点，但是仍具有去分化入有丝分裂期的能力（Gregoire et al., 1998b; Otto et al., 2005）。此时细胞处于静息生长脂基因在特异性转录因子的调控下使得静息生长的细胞进入分化期。此时 C/EBP 和 PPA达且协同作用来维持分化，使细胞出现成熟脂肪细胞的特征（Tontonoz et al., 1994）。调节脂肪细胞分化的转录因子脂肪细胞分化为脂肪细胞是一个受众多转录调节因子调控的精密过程。其中，C/EBP γ 在这一过程中有着重要作用，而其他一些转录调节因子固醇调节元件结合蛋白（SREBPel 样转录因子（KLFs）、激活蛋白-1（AP-1）、脂蛋白脂酶（LPL）等也直接或间接的参与化过程（图 1）。
（5） 多态位点与尾型的关联分析使用SAS 9.2软件中最小二乘法拟合线性模型，对BMP2和PDGF-D基因的单个多态位点或合位点与尾型进行关联分析。模型中参考的固定效应有场效应和品种效应，随机效应为基因型应。数据以最小二乘均值±标准误表示。单位点模型：y=μ+G+f+b+e组合位点模型：y=μ+G G G f+b+ey为性状表型值，μ为群体均值，G为BMP2或PDGF-D基因型效应，f为场效应，b为品种效应。为g.48401272C>A（BMP2）位点的基因型效应，G 为g.48401136C>T（BMP2）位点的基因型应，G 为g.48401272 C>A和g.48401136 C>T两个位点的交互效应，e为随机残差。（6） 生物信息学分析从UCSC网站（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables）获取PDGF-D基因启动子区序列JASPAR网站（http://jaspar.binf.ku.dk/cgi-bin/jaspar_db.pl）预测突变前后启动子区的转录因子结位点是否发生变化。2.3 结果与分析2.3.1 DNA 提取及 PCR 扩增
本文编号：2734041
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S826
【图文】：
这是前脂肪细胞分化必经的生长停滞期（GrowthArrest）（Pairaultetal.,19ire et al., 1998）。生长停滞期的细胞接收到成脂信号后，将重新进入细胞周期，进行多次，细胞此时处于有丝分裂克隆扩增期（Mitotic Clonal Expansion）。研究表明在克隆扩增，发生 DNA 的复制和染色体结构变化增加了顺式元件对作用因子的可接近性，这些作活或抑制决定了与脂肪细胞的分化相关基因的表达（Macdougald et al., 1995）。在细胞增殖后，前脂肪细胞会进入一个新的生长抑制期，称之为 GD 期（Scott et al., 1982）。的细胞虽然已经处于终端分化（Terminal Differentiation）的起始点，但是仍具有去分化入有丝分裂期的能力（Gregoire et al., 1998b; Otto et al., 2005）。此时细胞处于静息生长脂基因在特异性转录因子的调控下使得静息生长的细胞进入分化期。此时 C/EBP 和 PPA达且协同作用来维持分化，使细胞出现成熟脂肪细胞的特征（Tontonoz et al., 1994）。调节脂肪细胞分化的转录因子脂肪细胞分化为脂肪细胞是一个受众多转录调节因子调控的精密过程。其中，C/EBP γ 在这一过程中有着重要作用，而其他一些转录调节因子固醇调节元件结合蛋白（SREBPel 样转录因子（KLFs）、激活蛋白-1（AP-1）、脂蛋白脂酶（LPL）等也直接或间接的参与化过程（图 1）。
（5） 多态位点与尾型的关联分析使用SAS 9.2软件中最小二乘法拟合线性模型，对BMP2和PDGF-D基因的单个多态位点或合位点与尾型进行关联分析。模型中参考的固定效应有场效应和品种效应，随机效应为基因型应。数据以最小二乘均值±标准误表示。单位点模型：y=μ+G+f+b+e组合位点模型：y=μ+G G G f+b+ey为性状表型值，μ为群体均值，G为BMP2或PDGF-D基因型效应，f为场效应，b为品种效应。为g.48401272C>A（BMP2）位点的基因型效应，G 为g.48401136C>T（BMP2）位点的基因型应，G 为g.48401272 C>A和g.48401136 C>T两个位点的交互效应，e为随机残差。（6） 生物信息学分析从UCSC网站（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables）获取PDGF-D基因启动子区序列JASPAR网站（http://jaspar.binf.ku.dk/cgi-bin/jaspar_db.pl）预测突变前后启动子区的转录因子结位点是否发生变化。2.3 结果与分析2.3.1 DNA 提取及 PCR 扩增
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1 李青;绵羊BMP2和PDGF-D基因多态性与尾型的关联及细胞水平功能验证[D];中国农业科学院;2019年
本文编号：2734041
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