蝙蝠诺如病毒与正嗜肝DNA病毒的检测与鉴定

发布时间：2020-06-29 19:42

【摘要】：蝙蝠是世界上仅次于啮齿类动物的哺乳动物,分布于除地球两极以外的其它陆地。蝙蝠常作为许多人兽共患病的自然宿主而被关注。目前已从蝙蝠中发现了超过200种病毒,其中有很多病毒具有显著的公共卫生威胁,比如狂犬病毒、马尔堡病毒、SARS样冠状病毒和尼帕病毒等。我国南部地区经济发达、气候潮湿、温度适宜,适合蝙蝠生存,并且暴发过多起新发传染病,比如登革热、SARS和流感等。为了对福建和广西地区蝙蝠的新发传染病病毒有效地调查,防止蝙蝠病毒跨种和跨境传播给其他动物和人,保障人民生命安全,本课题对这两个地区蝙蝠携带病毒的病原生态学开展了系统的研究,并对新发现的诺如病毒和嗜肝DNA病毒进行了深入的病原学鉴定。本研究于2015年6月至2016年7月,从福建和广西13个市的29个地点共采集到758只蝙蝠样品,蝙蝠品种涉及到蝙蝠科(Vespertilionidae)和菊头蝠科(Rhinolophida的 5 个属,共 16 个种的蝙蝠。通过实验室特色的SVM分析技术,共获得14,014,153条reads,通过基因注释,其中0.65%(90,449)注释到了病毒。其中涵盖了 43个已知病毒科111个病毒属,还包括一些其它未分类的病毒。根据宿主的不同,这些已知病毒分为哺乳动物病毒、昆虫病毒、植物病毒和噬菌体。其中包含18个哺乳动物病毒科27个属、11个昆虫病毒科21个属、9个植物病毒科17个属、6个噬菌体科30个属。在哺乳动物病毒中,重要的有腺病毒科,乳头瘤病毒科,嗜肝病毒科,圆环病毒科,逆转录病毒科,细小病毒科,星状病毒科,呼肠孤病毒科,冠状病毒科,小RNA病毒科,黄病毒科,弹状病毒科,指环病毒科,内罗毕病毒科,汉坦病毒科,杯状病毒科等病毒科的成员。通过对福建以及广西蝙蝠所携带的哺乳动物病毒进行比较分析,发现福建省蝙蝠所携带的病毒包括10个哺乳动物病毒科12个属,广西蝙蝠所携带的病毒包括15个哺乳动物病毒科38个属,说明不同省份的蝙蝠所携带的病毒具有地域性的差异。在宏基因组发现的病毒中,由于诺如病毒和肝炎病毒具有重要的的公共卫生意义,而且它们在福建、广西的多样性特征和分布尚未明确,因此本研究对这2种蝙蝠病毒进行了分子鉴定。诺如病毒是仅次于轮状病毒能够在全世界范围内引起婴幼儿急性暴发性胃肠炎的病原,在发展中国家,每年能够导致约20万不到五岁儿童死亡。目前诺如病毒可分为6个基因群,即GI-GVI,具有明显的遗传多样性。每一个基因群都能够感染多种哺乳动物。根据病毒宏基因组测序结果和进一步的RT-PCR筛查,我们在福建省南平市的62只中菊头蝠中检测到了 2份蝙蝠诺如病毒阳性样品,阳性率为3.22%,对其中一份阳性样品中的诺如病毒进行了全基因组序列扩增,首次成功获得蝙蝠诺如病毒(NPIH26株)的全长基因序列,大小为7,363nt。基因组结构分析表明NPIH26具有典型的杯状病毒单链线性的基因组结构,同方向编码三个蛋白,分别是多聚蛋白,VP1和VP2。部分基因片段的同源性分析发现NPIH26与我国云南的菊头蝠中发现的诺如病毒BtRs-Ca1V/YN2010有最高的核苷酸同源性,为73%。为确定其进化关系,运用VP1基因进行遗传演化分析,把其和诺如病毒的其他六个基因群的成员进行比较,结果显示,NPIH26和BtRs-Ca1V/YN2010组成一个单独的分支,但是和诺如病毒的其它6个基因群不在同一个分支中,遗传距离较远。因此,NPIH26可以被认为是一个新的基因群,即基因7群——GVII。乙肝病毒是嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒属的原型代表,该病毒是人类最具有传染性的病原体之一,每年有88万人死于乙肝病毒感染。2013年,本实验室首次在缅甸的长翼蝠中分离到了蝙蝠肝炎病毒,并且作为一个新的种被ICTV收录。目前正嗜肝DNA病毒属中已经有4种蝙蝠肝炎病毒,这表明乙肝病毒在蝙蝠中的种类比在其他宿主中丰富。为了阐明福建和广西蝙蝠携带肝炎病毒的多样性特征,我们根据病毒宏基因组结果和进一步的PCR筛查,从广西河池采集的3只大蹄蝠中检测到了 2份蝙蝠肝炎病毒阳性,对2份阳性样品中的肝炎病毒进行全序列扩增,序列全长均为3,275nt,两者之间的同源性为99.8%,和从中国龙泉的中华菊头蝠中检测到的Longquan-Ha-273病毒的同源性最高,为96.4%。用全基因组序列进行系统进化分析,本实验中的两株病毒属于一种新的基因型。本研究应用病毒宏基因组学的方法对福建及广西蝙蝠的病毒组进行研究,揭示了该地区蝙蝠携带病毒的多样性特征和地域差异。在此基础上鉴定出新的蝙蝠诺如病毒基因群,并测定了国际上首株蝙蝠诺如病毒全基因组序列。此外,还发现了新的蝙蝠肝炎病毒基因型。本研究对进一步揭示蝙蝠诺如病毒和嗜肝DNA病毒的起源与遗传衍化以及阐明它们的公共卫生意义具有很重要的参考价值。
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

蝙蝠,地理分布,试剂

本课题组于２０１５年６月到２０１６年６月共采集到７５８只蝙蝠样品，包括福建逡逑的龙岩、三明和南平的１８２只蝙蝠和广西的桂林、柳州、来宾、百色、河池、崇逡逑左、南宁、钦州、玉林和北海的５７６只蝙蝠，这些蝙蝠的采集地点如图２－１所示。逡逑采样时，不同地方不同种类的蝙蝠都采集一定的数量，保证采集到的蝙蝠的多样逡逑性。我们对采集到的蝙蝠进行物种分类，一共包含有２个科：蝙蝠科逡逑和菊头幅科（施ｗｏ／ｏ／ｊ／ｚ／ｃ／ａｅ），５个属：黄幅属、长翼幅属、逡逑鼠耳蝠属、菊头蝠属和蹄蝠属，１６种蝙蝠。所有的蝙蝠外表健康，无病态表现。逡逑具体的种类和数量信息见表２－１。逡逑广，＼逡逑，ｃ＇、逡逑广西省逦福建省逡逑图２－１蝙蝠采样地理分布逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｇｅｏ－ｌｏｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂａｔ邋ｓａｍｐｌｉｎｇ逡逑２．１．２主要试剂及耗材逡逑试剂：逡逑核酸消化酶购自中国大连宝生物（ＴａＫａＲａ），核酸提取试剂盒：包括ＤＮＡ和逡逑１３逡逑

序列,蝙蝠,种类,病毒

Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｔａｘｏｎｏｍｙ邋ｓｕｍｍａｒｙ邋ｏｎ邋ｂａｔ邋ｓｐｅｃｉｅｓ．邋Ｔｈｉｃｋ邋ｂｌａｃｋ邋ｓｏｌｉｄ邋ｌｉｎｅｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｂａｔｓ逡逑ｆａｍｉｌｙ，邋ｔｈｉｎ邋ｂｌａｃｋ邋ｌｉｎｅｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｂａｔｓ邋ｇｅｎｕｓ．逡逑少，只有６２７个ｒｅａｄｓ，如图２－３所示。在这些序列中，ＧＸ０２１７组所含有的哺乳逡逑类动物病毒序列和噬菌体序列都是最多的，ＧＸ０２２３所含有的昆虫类病毒序列最逡逑多。逡逑对所得到的这些ｒｅａｄｓ进行分析，发现一共注释到了邋４３个病毒科和１１１个病逡逑毒属（哺乳动物病毒序列是经过ｂｌａｓｔ比对过，其他宿主的病毒序列未经ｂｌａｓｔ比逡逑对），病毒统计见表２－３，我们根据病毒宿主的不同，将这些病毒样序列分为哺乳逡逑动物病毒、昆虫病毒、植物病毒和噬菌体，并对不同宿主的病毒进行病毒分类。逡逑其中包含哺乳动物病毒１８个科２７个属、昆虫病毒１１个科２１个属、植物病毒９逡逑个科１７个属、噬菌体６个科３０个属。在哺乳动物病毒中，有腺病毒科逡逑（ｄ办ｎｗ／ｎ▲N先橥妨霾《究疲ǎ羞担瘚ａｖ／ｒ／Ｖ／_灒雀尾《究疲ò鞁＞／Ａｚｅ）

【参考文献】