应用于禽流感亚单位疫苗的表面抗原H5HA10的高效制备

发布时间：2020-06-30 04:31

【摘要】：禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒引起的,属于正粘病毒科,负链单股RNA病毒,普遍存在于禽类、人类及其他的动物中,血凝素是禽流感疫苗重要的蛋白质,是亚单位疫苗中常用的抗原成分。本试验中H5HA10由H5N1(内蒙古/10/2009由部分)亚型流感病毒血凝素基因经设计后截短的片段,该片段在血凝素抗原变异方面具有重要作用。试验将Spyligase技术应用于禽流感亚单位疫苗的表面抗原H5HA10的高效制备,将H5HA10序列的两端分别加上Spy Tag和KTag,命名为Spy-H5HA10,利用Spyligase技术将其形成多聚体蛋白,增加H5HA10的稳定性。构建九个带有不同可溶性标签的Spy-H5HA10重组表达载体,分别在大肠杆菌中表达,选择表达量高的重组蛋白。将Spyligase连接在带有His-Cherry标签的p ET21b载体上,在大肠杆菌中表达。首先,使用Bam H I和Xho I双酶切获得目的基因Spy-H5HA10,将其连接在九种带有不同促溶性标签的载体上,分别将其转化进BL21感受态细胞中,Xho I和Nde I双酶切鉴定正确后,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE电泳对融合蛋白的表达量和可溶性进行分析,筛选出表达量高可溶性好的促溶标签,其中p ET21b-His-Ars C-H5HA10蛋白的可溶性表达水平超过了95%。用同样的方法,Nhe I和Xho I双酶切获得目的基因Spyligase,将其连接在带有His-Cherry的可溶性标签的p ET21b载体上,转化进入BL21感受态细胞中,Xho I和Nde I双酶切鉴定正确后,经IPTG诱导,通过SDS-PAGE电泳分析其融合蛋白的表达量和可溶性,其表达量高可溶性好。其次,将p ET21b-His-Ars C-H5HA10和p ET21b-His-Cherry-Spyligas通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,并获得了高纯度的Spy-H5HA10和Spyligase重组蛋白。最后,将获得高纯度的Spy-H5HA10与Spyligase混合后,在4℃PCT缓冲液中反应,通过SDS-PAGE电泳分析Spy-H5HA10形成单聚体,二聚体甚至是多聚体。本试验成功构建了九种不同促溶性标签的H5HA10的重组载体,一种含有可溶性标签的Spyligase重组载体;摸索并成功地获得高纯度的重组蛋白;重组蛋白形成多聚体蛋白;探究Spyligase技术的实用性,为禽流感亚单位疫苗的后续研究奠定了试验基础。
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4
【图文】：

表达载体,可溶性,标签,载体

图 1 试验中构建成功的表达载体Fig.1 Constructing successful expression vectors.1.1 十种重组表达载体的酶切获得BamH I 和 Xho I 双酶切获得了含有九种可溶性标签的 pET21b 载体线性片is6-pAs200、His-XTEN、His6-ArsC、His6-PEAT 、SiTag3-SUMO、SiTag3-MBP、Si

载体,标签,相对分子质量,目标

图 2 BamH I 和 Xho I 双酶切获得载体Fig.2 Get vectors by Xho I and BamH INA 相对分子质量标准；1-9. pET21b-His-ArsC、pET21b-His-pAs200、pET21b-His-Xis-PEAT-、pET21b-SiTag3-SUMO、pET21b-SiTag3-MBP、pET21b-SiTag3-pAs200、Tag3-XTEN 和 pET21b-SiTag3-AesC 经 BamH I 和 Xho I 双酶切获得含有目标可溶标签

【参考文献】