弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列SRS47D生物学特性的初步研究

发布时间：2020-06-30 06:38

【摘要】：刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)又称弓浆虫,能感染人和200多种其他脊椎动物,寄生于所有有核细胞。作为机会性致病寄生虫,其终末宿主为猫科动物,人及其它畜禽均可成为其中间宿主,属人兽共患寄生虫。弓形虫病呈世界性分布,给公共卫生安全带来了极大的挑战。弓形虫发育过程可见速殖子、缓殖子、配子体、包囊、裂殖体五种阶段。在中间宿主体内,当环境适宜时,以速殖子形式存在于有核细胞内,进行内二分裂或内芽生增殖;在终末宿主猫科动物体内,大小配子体结合形成卵囊,在小肠绒毛上皮细胞内发育成熟。弓形虫感染形式多种,可经消化道黏膜、胎盘、血液、损伤的皮肤等途径感染,通过血液循环系统到达全身有核细胞内。作为一种重要的食源性寄生虫,经消化道感染弓形虫是其主要的感染途径,全世界约三分之一的人感染弓形虫。作为机会性致病寄生虫,机体的免疫状况对弓形虫感染及病程起重要作用。发达地区血清阳性率相对欠发达地区为低。随着猫狗等伴侣动物饲养的日益普遍,经猫狗粪便污染食物感染弓形虫的比重逐渐升高;而在食品生产过程中,生熟不分导致交叉污染也增加了弓形虫感染的风险。本文首先对刚地弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列(Surface antigen glycoprotein 1-related sequences)SRS47D蛋白进行了生物信息学分析,预测其免疫原性及功能。利用在线软件ProtParam、SOSUI、SOPMA、TMHMM、MotifScan和SYFPEITHI,预测SRS47D的一、二、三级结构、组成、抗原表位及潜在功能。结果显示,SRS47D蛋白含有376个氨基酸,分子质量约为40 ku。在其二级结构中,α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规则卷曲分别占23.14%、19.68%、2.39%和54.79%。SRS47D蛋白具有信号肽序列、18个亲水区域(临界值为1.9)、8个柔性区域(临界值为2)和17个表面可及性区域(临界值为1.9),但无跨膜结构区。其翻译后修饰位点中包含两个糖原合成酶激酶位点和两个O-GlcNAc糖基化位点,而不存在N-GlcNAc和C-GlcNAc糖基化位点。与弓形虫表面抗原糖蛋白1(SAG1)蛋白三级结构比对发现,在β折叠处存在重叠。SRS47D蛋白具有24个限制性CTL细胞表位、13个限制性Th细胞表位和10个B细胞抗原表位,提示SRS47D蛋白的免疫原性较好,是潜在的弓形虫病疫苗候选分子。为表达弓形虫SRS47D基因、确定SRS47D蛋白在弓形虫中的定位,通过RT-PCR方法扩增SRS47D基因,插入原核表达载体pColdⅠ,构建重组表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况,Western blot分析重组蛋白的反应原性;利用His柱纯化重组蛋白,免疫新西兰白兔,制备抗血清,通过间接ELISA检测血清效价;利用免疫荧光法检测蛋白在弓形虫速殖子中的定位。结果显示,成功构建了原核表达质粒pColdⅠ-SRS47D,在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,表达产物大小约为55 ku;重组蛋白能与感染弓形虫的小鼠血清发生特异性反应;免疫兔血清效价达到1:51 200;免疫荧光检测结果显示,SRS47D蛋白分布在弓形虫速殖子表面,尤其是前部和后部表膜。研究结果为进一步深入研究弓形虫SRS47D的特性和功能奠定了基础。为探究弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列SRS47D与SRS37A、SRS23蛋白之间的互作关系,以及不同结构域间的互作模式,构建了SRS47D、SRS37A和SRS23基因,以及SRS47D、SRS37A蛋白各2个结构域编码基因的双分子荧光互补质粒,分别共转染Vero细胞,利用双分子荧光互补技术,观察其是否存在互作关系;同时,利用免疫荧光共定位和激光共聚焦显微技术,进一步检测SRS47D与SRS37A、SRS23蛋白之间的互作关系。结果成功地构建了SRS47D、SRS37A和SRS23基因,以及SRS47D、SRS37A蛋白各2个结构域编码基因的双分子荧光互补质粒;双分子荧光互补实验显示,SRS47D与SRS37A发生相互作用,而与SRS23不发生相互作用;SRS47D-D1、SRS47D-D2与SRS37A-D1、SRS37A-D2均发生相互作用;免疫荧光共定位显示,SRS47D与SRS37A共定位在弓形虫速殖子表面多个部位,尤其是前、后部外膜。根据这些结果,推测SRS47D的两个结构域与SRS37A的两个结构域之间存在紧密的两两互作关系,而SRS47D与SRS23之间不发生相互作用。首次探究了重组蛋白rSRS37A、rSRS47D、rSRS37A与rSRS47D联合免疫对小鼠弓形虫感染的保护效果。对免疫小鼠产生的抗体水平、抗体的体外阻断能力、脾淋巴细胞增值能力、细胞因子消长变化、T淋巴细胞亚型鉴定及感染小鼠存活时间等进行了测定。结果显示,rSRS37A、rSRS47D、rSRS37A和rSRS47D蛋白联合免疫小鼠均能使小鼠产生显著的IgG水平(p0.0001)。50、100、200、300、400μg/mL兔抗rSRS47D IgG均能显著抑制弓形虫入侵Vero细胞(p0.05),且随着IgG浓度的提高,阻断效果不断提高。3个免疫组均能极显著地刺激脾淋巴细胞的增殖(p0.0001),而对照组之间差异不显著(p0.05)。rSRS47D、rSRS37A和rSRS47D试验组IL-17A分泌水平在1免后2 w显著升高(p0.05),而此时IL-6分泌水平才刚开始上升;2免后1 w,IL-17A分泌水平较1免后2 w有所下降,而IL-6分泌水平达到最高;3免后,IL-6分泌水平随IL-17A分泌水平的变化而变化,提示IL-6的分泌滞后于IL-17A。TNF分泌水平呈现先升高,再有所下降,然后再次升高的过程。rSRS37A实验组在1免后2 w IFN-γ分泌水平即显著升高(p0.0001);3个试验组及PBS+佐剂组在第3 w均极显著升高(p0.0001),此后有所下降。人工感染弓形虫强毒株后,3个对照组小鼠均在第7 d-第9 d之间全部死亡,rSRS37A、rSRS47D、rSRS37A+rSRS47D免疫组分别在第8 d-第10 d、第9 d-第12 d、第11 d-第15 d死亡,存活时间上存在显著差异(p0.05)。提示rSRS37A、rSRS47D、rSRS37A+rSRS47D均具有不同程度的免疫保护效果。综上所述,本研究利用生物信息学软件预测了弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列SRS47D蛋白的结构和潜在功能;体外重组表达了SRS47D蛋白;发现SRS47D蛋白主要分布于弓形虫速殖子表面,尤其是前部和后部表膜;SRS47D与SRS37A蛋白之间存在互作关系,且SRS47D的两个结构域与SRS37A的两个结构域之间存在紧密的两两互作关系;rSRS37A、rSRS47D、rSRS37A与rSRS47D联合免疫对小鼠弓形虫感染存在部分保护效果。研究结果为深入了解弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列SRS47D的功能和特性、利用该分子开展弓形虫病防控新策略研究打下了基础。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.72
【图文】：

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硕士学位论文第二章刚地弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列 SRS47D 的生水性分析小调整为 11（默认为 9）时，ProtScale 输出图形显示，SRS47D 存在1.5）峰，分别位于 20-29、313-315、362-369 氨基酸残基处，最高峰值处。而 14 个低分值（scare<0）峰位分别位于第 9-12、14-15、37-38、52、155-180、190-204、208-221、230-249、261-265、277-307、319-3值位于第 325 位的脯氨酸。（图 2.1）

蛋白信号,位点

图 2.2 蛋白信号肽分析Fig 2.2 Protein signal peptide analysisS47D 蛋白序列前 70 个位氨基酸残基；Y 轴为计分（score）；C 值表示剪切位点号肽计分，用绿色显示；Y 值是基于 S 值和 C 值的综合计分值，用蓝色表示。is showed the amino acid residues in the first 70 positions of the SRS47D sequence. The. C value indicated the scores of the shearing site, marked in red. S value presented tere displayed in green. The Y value were a comprehensive scores based on the S valueue.后蛋白修饰位点预测化修饰位点分析，当给定阈值大于 90%时，预测结果显示有 25 个丝氨酶位点，0 个酪氨酸激酶位点，0 个组氨酸激酶位点。25 个丝氨酸激酶激酶位点，分别位于第 213 位和 346 位氨基酸残基，有 3 个 Auated kinase，Aurora）的磷酸激酶位点；其余 20 个均为共济失调症突变 mutated，ATM）磷酸激酶位点。Ac 糖基化位点分析，当给定阈值大于 90%时，预测结果显示在 173 位

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