【摘要】：近年来,流感病毒感染性与致病性的改变给公共卫生安全造成了越来越严重的威胁。因此,流感病毒的毒力因子及致病机制研究对于流感的防控及抗病毒药物的研制至关重要。最近研究发现流感病毒片段3不仅编码PA蛋白,还编码一种新型蛋白"PA-X"。PA-X是一种融合蛋白,其N-末端的191个氨基酸由PA开放阅读框编码,而C末端氨基酸由+1核糖体移码而产生的开放阅读框编码。之前对PA-X的功能研究仅局限于1918H1N1历史上流行的具有特殊性的病毒株。PA-X在当前流行的流感病毒毒株,包括2009大流行H1N1人群流行毒株以及H5亚型禽流感病毒中的功能及其作用机制需要进一步阐明。 为了了解PA-X基因在目前流行流感病毒中的功能及其作用机制,我们利用定点突变技术及反向遗传操作技术构建了pHIN1和H5N1PA-X缺失病毒,通过比较分析pHINl和H5N1亲本病毒及其对应的PA-X缺失病毒在体外细胞系及小鼠模型中的复制力及致病性,来探究PA-X基因在pH1N1和H5N1病毒中的作用。为了进一步揭示PA-X影响病毒致病性的机制,本研究评价了PA-X缺失后病毒的聚合酶活性、PA蛋白的表达水平以及PA蛋白的功能变化包括PA蛋白的核蓄积能力及PA蛋白抑制基因合成能力等。研究结果表明：(1)PA-X缺失增强了pH1N1和H5N1病毒在A549细胞中的复制水平及诱导A549细胞的凋亡水平。(2)小鼠实验表明PA-X缺失显著增强了pH1N1和H5N1病毒的致病性,这与PA-X缺失病毒在小鼠肺脏中的高水平复制和诱导产生高表达的炎性细胞因子有关。(3)进一步研究发现：PA-X缺失可能是通过提高pH1N1和H5N1病毒PA蛋白的表达水平,增强病毒的聚合酶活性,从而增强病毒的复制力及致病性。(4)PA-X缺失还影响PA蛋白功能。在pHlNl和H5N1病毒背景下,PA-X缺失的PA蛋白核蓄积能力明显增强,然而其抑制共转染基因的能力发生了显著性下降,表明PA-X在抑制宿主蛋白合成中起到重要的作用。 PA-X基因遗传进化分析表明,流感病毒根据PA-X的X-ORF长度可分为两组：表达全长PA-X的病毒(X-ORF是61个氨基酸,全长252个氨基酸)和表达截短PA-X的病毒(X-ORF是41个氨基酸,全长232个氨基酸)。全长和截短的PA-X相差ORF C末端233-252位的20个氨基酸。所有的禽流感病毒包括H5N1和H9N2病毒均表达全长的PA-X蛋白,而以pHlNl病毒为代表表达截短的PA-X蛋白。然而,这两种形式的PA-X蛋白在流感病毒中的功能是否相同仍不得而知。为了确定这两种形式的PA-X在流感病毒中的功能是否存在差异,我们以pHIN1、H5N1和H9N2病毒为现流行于人群和禽群中的代表毒株探究了PA-X基因C末端20个氨基端对流感病毒复制力及致病性的影响。本研究通过延长pH1N1病毒的PA-X以及截短H5N1和H9N2病毒的PA-X,并评价PA-X延长或截短后病毒体内外生物学特性的变化,以揭示PA-X蛋白C末端233-252位的20个氨基酸在流感病毒中的作用。研究结果表明：(1)在这三株病毒背景下,表达全长PA-X的病毒与表达截短PA-X的病毒相比能够在人肺脏细胞系中更好的复制和诱导更高的细胞凋亡水平。(2)小鼠实验表明表达全长PA-X的pHIN1、H5N1和H9N2病毒对小鼠致病性显著强于其对应的PA-X截短病毒。表达全长PA-X的病毒较PA-X截短病毒在小鼠肺脏中的高病毒滴度和诱导的高表达的炎性细胞因子可能是其致病性增强的关键因素。(3)进一步实验证明：PA-X延长或截短虽不影响PA蛋白的表达水平,但是表达全长PA-X的PA质粒较PA-X截短的PA质粒能够更有效地抑制外源蛋白的表达。而且,体外共转染pEGFP和只表达C末端20个氨基酸的质粒试验直接验证了PA-X基因C末端233-252位氨基酸具有强烈地抑制蛋白合成的能力。这一结果暗示：表达全长PA-X的病毒能够更有效的抑制宿主蛋白的合成,有利于病毒本身的复制及传播,这可能与其致病性增强密切相关。上述研究结果表明PA-X基因C末端233-252位氨基酸是A型流感病毒的重要毒力调控因子。 综上所述,研究表明PA-X缺失可能通过上调PA蛋白的表达水平来增强病毒的聚合酶活性,从而有利于病毒本身的复制：PA-X缺失病毒诱导的细胞凋亡水平上调及宿主炎症反应增强可能是其致病性增强的关键因素。PA-X蛋白C末端20个氨基酸能够强烈抑制共转染基因的表达,这可能会增强全长PA-X蛋白抑制宿主蛋白合成的能力,从而增强病毒体内外的复制力及致病性。本研究解析了PA-X基因在调控目前流行流感病毒致病性及致病机制中的作用,并揭示了不同形式的PA-X基因在目前流行流感病毒中的功能差异,为阐明流感病毒致病性的分子机制奠定了重要的理论基础。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【图文】：
图 2-1 pUW2000 质粒图谱（Hoffmann e/fl/.. 2000)Fig. 2-1 pIIW2000 vector map (Hoffmann et al., 2000)2.2.5病毒RNA的提取
2-2 pHlN丨和H5N1病毒PA-X缺失的PA基因片段PCR纯化回收g. 2-2 PCR products of PA gene in absence of PA-X of pH IN land H5N1 Trans5K DNAMarker(5000bp，3000bp，2000bp, 1500 bp, lOOObp,-FSPA。传操作系统质粒敲除PA-X的PA基闪H5N1病怳突变后的PA基闪与PHW2000载体丨丨j Bsmbl接突变的PA基闪与PHW2000载体，转化Trans-Tl测序，确定PA基闪发生正确突变且无其他点突变后（图
【共引文献】
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2735502
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