无乳链球菌跨宿主感染机制的比较基因组学研究

发布时间：2020-06-30 17:35

【摘要】：无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)又称B 组链球菌(GroupB Streptococcus,GBS)可感染包括人、奶牛、鱼等在内的多种宿主。GBS感染人可引起孕妇早产、新生儿败血症和脑膜炎、成年人软组织感染和脑膜炎,感染奶牛造成奶牛乳腺炎严重影响牛奶的产量和质量,感染鱼类引起脑膜脑炎造成大面积养殖鱼类死亡。牛奶和鱼类是人类重要的食物蛋白来源,规模化养殖的奶牛和鱼类与人类接触密切,而人对GBS的高携带率,造成GBS在人、牛和鱼间的跨宿主感染风险极高。但目前临床人牛或人鱼间是否存在交叉感染或牛和鱼是否可作为感染人GBS的储存池及人源GBS是否在牛和鱼进行传播还未有定论。因此,有必要对GBS跨宿主感染风险进行评估并研究其跨宿主感染机制。基因水平转移促进了细菌基因组的快速演变,并可能参与菌种的形成。GBS种内或种间基因组重组频繁发生并且可发生基因组大片段的交换,造成GBS基因组呈马赛克结构,是GBS遗传分化的主要驱动力。可移动遗传元件(MGEs)包括结合性质粒、噬菌体、转座子和整合接合元件(ICEs)等。通过基因水平转移可造成GBS种内基因组分化和毒力克隆的出现,影响GBS的生态位和宿主适应性。对毒力差异和宿主特异性的GBS菌株进行比较基因组学研究,可快速获得非必需基因、基因缺失或突变、差异表达蛋白等相关信息,是研究GBS跨宿主感染、致病性和免疫原性的有效途径。因此,本研究首先对在广西地区收集的92株人源致病性GBS进行了荚膜血清型、MLST、PFGE、抗生素抗性和毒力相关基因分析,通过动物感染试验及病理组织切片研究人源GBS对罗非鱼的致病性,进而有针对性的对跨宿主感染能力不同的人源GBS菌株开展基因组测序、泛基因组、全基因组系统进化分析、基因组序列变异分析、CRISPRs结构和前噬菌体分析等比较基因组学研究,探讨GBS的跨宿主感染机制。主要取得以下结果:1.92株人源GBS分别来源于19种疾病,其中来源妇女菌株最多,占总菌株数的75%。MLST分析发现CC103菌株比例极显著升高(20株,21.74%),特别是ST485(13株,14.13%)可感染包括新生儿在内造成多种疾病;发现3株被认为是特异性感染奶牛的CC67菌株,并且重组获得了ST17菌株特有超强毒力基因gbs2018C。牛源和人源CC103菌株交错构成独立进化分枝,3株人源CC67菌株与特异性感染奶牛的ST61和ST67菌株聚为同一进化分枝。2.92株人源GBS跨宿主感染罗非鱼,发病罗非鱼表现出体色发黑、出血、转圈等典型症状,病理组织切片分析发现GBS可突破血脑屏障进入脑组织并大量增殖。同时发现所有ST23菌株(21株,22.83%)对罗非鱼具有高致病性,而ST19菌株对罗非鱼致病性与菌株血清型存在关联,17株血清型Ⅲ的CC19菌株对罗非鱼的致病力全部较弱或无致病性,而11株血清型V的CC19菌株和1株血清型Ⅱ的CC19菌株对罗非鱼的致病力全部较强。2株人源致病性ST1菌株对罗非鱼致病性截然不同,NNA048对罗非鱼的致病力与罗非鱼源GBS无差异,而NNA038对罗非鱼确无致病力。3.比较基因组学研究显示牛源和人源的GBS CC103菌株具有很近的亲缘关系,CC103菌株在人和牛交叉传播并进化出多个菌群进化分枝,其中ST485菌群进化分枝的菌株特异性感染人且具有高致病力,该菌群菌株相对其他CC103菌株基因组均发生Lac.2缺失和CadDX基因获得。4.罗非鱼高致病力和无致病力ST23 GBS菌株基因组比较和前噬菌体分析结果显示菌株间的差异主要为前噬菌体序列。其中P1区域的前噬菌体GC含量为43%左右,编码28～39个蛋白,介导GBS通过噬菌体重组获得细菌毒素-抗毒素系统的YafQ/DinJ结构。具有该前噬菌体的ST23 GBS对罗非鱼无致病性,而不具有该前噬菌体或该前噬菌体发生了基因变异或缺失(特别是缺失YafQ/DinJ结构)ST23GBS对罗非鱼具有高致病性。罗非鱼高致病力和无致病力ST1 GBS菌株NNA048和NNA038基因组比较结果显示基因组差异主要为噬菌体序列差异,NNA048基因组特异具有一个长度为49.8 kb编码68个蛋白的完整噬菌体序列,基因组间共有96个SNVs和 6 个 indels。5.GBS ST19血清型Ⅲ菌株的核心基因数量比例(67.09%)低于血清型V菌株(70.59%)。系统进化分析结果显示Ⅲ型菌株间的进化距离比V型菌株间的进化距离更远。血清型Ⅲ菌株的CRISPRs结构比血清型V菌株的结构更复杂,插入序列数量和类型均多于V型菌株。基因组比较结果显示血清型Ⅲ菌株和血清型V菌株的荚膜多糖区域(约111 kb)及与其毗邻的ICEs区域(约106kb)发生了大片段重组。荚膜多糖区域包括整个荚膜多糖操纵子。血清型Ⅲ菌株的ICEs区域包含具有mega element的ICE且菌株间变异较大,而血清型V菌株的ICEs region包含具有IQ element和erm(TR)的ICEs且菌株间非常保守。综上所述,本研究首先明确了人源不同血清型、CC群或ST型GBS对罗非鱼的致病性及部分菌株与牛源菌株的关系,然后通过比较基因组学探讨了不同类群GBS的跨宿主感染机制,发现了 ICEs、噬菌体、荚膜多糖、YafQ/DinJ、Lac.2和CadDX等基因组结构或相关基因在GBS跨宿主感染中的重要作用,对GBS流行疾病的防控及疫苗开发具有重要意义,为进一步阐明GBS的跨宿主感染机制打下基础。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S943;S855.99
【图文】：

菌毛,基因,检出率,检出

３．６．１菌毛岛逡逑ＧＢＳ邋菌毛岛共有邋４邋种类型（ＰＩ－２ａ、ＰＩ－２ｂ、ＰＩ－ｌ＋ＰＩ－２ａ、ＰＩ－ｌ＋ＰＩ－２ｂ）。通过邋ＰＣＲ邋检逡逑测，９２株ＧＢＳ菌株中均表现为这４种类型菌毛岛的至少其中１种类型（图１－３）。所有逡逑菌株中不是检出有ＰＩ－２ａ邋（检出率６５．２％），就是检出有ＰＩ－２ｂ邋（检出率３４．８％）。而ＰＩ－１逡逑的检出率是４８．９％，分别与ＰＩ－２ａ或ＰＩ－２ｂ形成组合类型。４种菌毛岛类型中，ＰＩ－２ａ型逡逑为最常见型，其次分别是ＰＩ－ｌ＋ＰＩ－２ａ、ＰＩ－２ｂ和ＰＩ－ｌ＋ＰＩ－２ｂ。菌毛岛类型与ＳＴ有很强的逡逑相关性，ＳＴ１７邋（１０／１０，１００％）和邋ＳＴ４８５邋（１３／１３，１００％）全部表现为邋ＰＩ－２ｂ邋型，ＳＴ２３逡逑（１０／１０，１００％）则全部表现为邋ＰＩ－２ａ邋型，ＳＴ１９邋（２３／２３，１００％）和邋ＳＴ１０邋（４／４，１００％）逡逑全部表现为ＰＩ－ｌ＋ＰＩ－２ａ型。ＰＩ－ｌ＋ＰＩ－２ｂ仅检出２株，均属于ＣＣ６７。菌毛岛类型与血清学逡逑也有一定的相关性，血清型ｌａ大部分菌株（１６／２６，邋６１．５％）表现为ＰＩ－２ｂ型，而血清型逡逑ｌｂ邋（９／１３

罗非鱼,侵袭性,实验结果,血清型

后死亡数在３？５尾，定议为“中等”的１８株细菌感染罗非鱼后死亡数在０？３尾，定逡逑义为“弱”的２２株细菌和定义为“不能感染”的１４株细菌感染罗非鱼后未出现死亡。逡逑进一步分析发现（图１－５），９２株人源ＧＢＳ对罗非鱼致病性与其ＳＴ／ＣＣ和血清型存在很逡逑大的关联，如１０株血清型ｌａ的ＳＴ２３菌株对罗非鱼均具有高致病性（“超强”），１７株血逡逑清型ＩＩＩ的ＣＣ１９菌株对罗非鱼的致病力全部较弱（４株“不能感染”，１１株“弱”，２株逡逑“中等”），而１１株血清型Ｖ的ＣＣ１９菌株和１株血清型ＩＩ的ＣＣ１９菌株对罗非鱼的致病逡逑力均较强（１株“超强”，１１株“强”）。血清型ｌａ的ＣＣ１０３不同ＳＴ型菌株对罗非鱼致逡逑病性存在很大差异，１株ＳＴ１０３和２株ＳＴ９３０邋（ＳＴ１０３的ＳＬＶ）致病性均很强（全部为逡逑“超强”），而１３株ＳＴ４８５致病力均较弱（５株“不能感染”，２株“弱”，６株“中等”）。逡逑所有感染死亡罗非鱼均表现出典型的临床症状，如嗜睡、厌食、不规则游动、鳍基部出逡逑血、双侧或单侧眼球突出变浑浊

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