山羊miR-487b-3p靶向作用IRS1调控骨骼肌肌生成机制研究

发布时间：2020-06-30 22:28

【摘要】：非编码RNA包括microRNAs,Long non-coding RNAs,以及Circular RNAs,是当今生命科学领域中研究最热门的一个分支。其中,目前研究最为普遍的是microRNAs。MicroRNAs是一类短小的、高度保守的、内源性非编码RNA,在骨骼肌的发育过程中发挥着至关重要的调控作用。在本研究中,参考实验室对徐淮山羊骨骼肌microRNAs高通量测序的结果,结合RT-qPCR分析miR-487b-3p在徐淮山羊不同发育时期(胎羊时期、成年羊时期),不同组织(心、肝、脾、肺、肾、小肠、背最长肌、腿肌)的表达谱,并构建miR-487b-3p过表达载体以及合成miR-487b-3p化学模拟物分别转染成肌细胞(C2C12),研究其在骨骼肌肌生成过程中调控作用。此外,还对miR-487b-3p的靶基因IRS1进行预测和功能探究。本研究内容和主要结果如下:(1)利用miRBase,Targetscan数据库对miR-487b-3p及其靶基因IRS1 3’UTR序列保守性进行分析,发现mi R-487b-3p成熟序列以及与IRS1 3’UTR结合区序列在山羊、人、小鼠、牛以及绵羊等物种间具有高度的序列保守性。(2)miR-487b-3p在徐淮山羊不同发育阶段(胎羊时期、成年羊时期)、不同组织中都广泛表达,miR-487b-3p在胎羊和成年羊肌肉组织的表达量高于其他组织,且miR-487b-3p在徐淮山羊胎羊肌肉组织中的表达量显著高于其在成年羊肌肉组织中的表达量,表明mi R-487b-3p属于非肌肉特异性microRNA,且可能在肌肉发育过程中有着重要的调控作用。(3)将pcDNA3.1(+)-miR-487b-3p、miR-487b-3p mimics、negative control(NC)、miR-487b-3p inhibitors、anti-negative control(anti-NC)转染至C2C12细胞,分别过表达miR-487b-3p或者抑制miR-487b-3p表达。经RT-qPCR和Western blot实验探究过表达miR-487b-3p或抑制miR-487b-3p表达对C2C12成肌细胞增殖、分化的影响;此外,结合CCK-8和EdU实验共同探究miR-487b-3p对C2C12成肌细胞的影响。结果表明,miR-487b-3p抑制成肌细胞(C2C12)的增殖和分化。(4)成功构建了miR-487b-3p 3个靶基因IRS1、ITGA6、ZMYND8的野生型和突变型荧光素酶报告基因载体。双荧光素酶报告基因实验证明miR-487b-3p可以靶向作用于IRS1、ITGA6和ZMYND8 3’UTR区。基于生物信息学(David、KEGG)分析、RT-qPCR和Western blot实验发现:miR-487b-3p抑制IRS1的表达。(5)通过RNAi实验,结合Western blot、EdU进一步探究发现,抑制IRS1表达会抑制C2C12成肌细胞增殖、分化,与过表达miR-487b-3p趋势一致。(6)IRS1在将信号从胰岛素或胰岛素样生长因子受体传递至MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路的过程中起关键作用;实验结果揭示了mi R-487b-3p调控骨骼肌肌生成的机制,即miR-487b-3p通过作用IRS1,参与MAPK/ERK和PI3K/AKT通路的调控网络,进而对骨骼肌成肌细胞增殖、分化产生影响。
【学位授予单位】：江苏师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S827
【图文】：

信号通路,肌生成,骨骼肌

江苏师范大学硕士学位论文II 的抑制作用，进而促进骨骼肌的肌生成；PI3K 介导的 PI3K/AKT/mTOR/p70S6K信号通路在骨骼肌肌纤维形成过程中也有着重要的调控的作用[37-38]。IGF-I—MAPK 信号通路，PI3K—AKT 信号通路，AKT—mTOR—p70S6K 信号通路在调控肌肉发育过程中的作用[39]（如图 1-1 所示）。

示意图,形成机制,示意图,前体

1.2.1 microRNAs 的形成机制microRNAs 的生物发生起始于基因组 DNA，由 RNA 聚合酶 II 将 miRNA 基因转录成含有 5’“帽子”和 3’多聚 A（polyA）“尾巴”结构的 miRNA 的初级转录物（pri-miRNA）[43]；随后，初级转录物经过 Drosha 酶（RNA 核酸内切酶）和其他辅助因子的“切割”作用下，形成 60-70 nt 的小发卡 RNA，即前体 miRNA（pre-miRNA）；接着，前体 miRNA 通过依靠三磷酸鸟苷蛋白（ran-GTP），由转运蛋白（Exportin-5）将其从细胞核转运至细胞质中[44-45]。位于细胞质中前体 miRNA经过 Dicer 酶和双链结合蛋白（TRBP）的共同作用下，形成 20-24 nt 的双链 RNA（dsRNA）；随后，根据热力学稳定性以及解旋酶的作用下，来源于 dsRNA 的两条不同的成熟 miRNA 首先有一条 miRNA 在 AGO 蛋白参与下具备靶基因识别能力的 RNA 诱导的沉默复合体（RISC），发挥其相应的功能；而另一条成熟的 miRNA通常则会被降解[46-48]（如图 1-2 所示）。

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