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亚洲1型口蹄疫疫苗毒株的自然重组株生物学特性研究

发布时间:2020-07-01 11:04
【摘要】:口蹄疫被OIE列为法定上报的动物疫病,是国际贸易关注的重要疫病之一,其对经济和政治影响巨大。为有效防控口蹄疫,不同国家和地区根据国情及口蹄疫流行情况采取扑杀或疫苗免疫结合扑杀的措施,我国采用疫苗免疫结合扑杀的综合防控措施。为保证口蹄疫防控效果,疫苗产品质量至关重要。本研究针对口蹄疫亚洲1型疫苗种毒培养、产品质量检验过程中发生的异常展开研究,旨在为种毒监测、产品质量控制提供新的思路。研究发现口蹄疫病毒Asia-1/HN/06在适应无血清悬浮培养BHK-21细胞后VP1基因的3’末端(即第619位核苷酸后)有12nt插入(GTTGACTTAGTA,编码VDLV)。高通量测序证实病毒在无血清悬浮培养BHK-21细胞第4代发生插入变异,并且变异病毒所占比例随病毒传代逐渐增加。通过蚀斑克隆分离出含12nt插入变异毒株,命名为Vac-Asia-1-VDLV。为确定12nt插入序列的来源,通过核苷酸序列Blast分析及宿主细胞转录组测序,确定该序列来源于BHK-21细胞mRNA。通过对样品reads数据库分析,BHK-21细胞转录组中有3条mRNA含12nt相同序列,结合侧翼匹配序列长度、RNA重组机制以及mRNA变化水平分析,其中secernin-3蛋白的编码基因表达量明显高于对照组,并且该mRNA含有与12nt及两翼最长匹配序列,其作为供体与病毒重组的可能性最高。生物学特性研究结果表明Vac-Asia-1-VDLV病毒在BHK-21细胞中蚀斑形态变化不明显,可在CHO-K1及衍生细胞中生长,病毒滴度超过1×10~5PFU/mL。而Asia-1/HN/06在CHO系列细胞中感染率极低,没有蚀斑。表明Vac-Asia-1-VDLV能感染缺失整联蛋白及HS受体的细胞,可利用第三类受体。经反向遗传操作将编码VDLV的12nt序列插入到病毒O/CHA/90,结果表明其蚀斑形态、生长曲线及对CHO-K1系列细胞感染特性与亲本株O/CHA/90病毒相比无明显变化,说明12nt插入序列对病毒在BHK-21细胞的生长特性影响不大,对病毒利用第三类受体影响有限。病毒对乳鼠的半数致死量(LD_(50))及对牛的致病力结果显示Vac-Asia-1-VDLV及Asia-1/HN/06病毒对乳鼠的致病力差异不明显而对牛的致病力差异较大。Vac-Asia-1-VDLV病毒接种的3头牛均未出现临床症状及体温升高情况,未出现明显病毒血症。Asia-1/HN/06病毒接种牛表现出明显的口蹄疫症状并有体温反应,出现明显的病毒血症和排毒现象。表明Vac-Asia-1-VDLV对牛的致病力明显减弱,分析原因为RGD突变为GGD以及12nt插入序列影响了Asia-1型口蹄疫病毒对牛的致病力。综上所述,本研究首次报道了宿主细胞mRNA与口蹄疫病毒发生重组,通过转录组测序分析了供体mRNA来源,研究了重组病毒受体利用情况及对本动物致病力等的影响,丰富了口蹄疫遗传变异内容。本研究中亚洲1型口蹄疫病毒适应细胞产生的变异对免疫效果影响很大,也为口蹄疫疫苗生产中种毒监测的必要性提供了充分证据。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:S852.65
【图文】:

树图,口蹄疫病毒,遗传进化,树图


图 1.1Asia-1 型口蹄疫病毒代表毒株遗传进化树图(Mega7.0.26)注:“○■▲●△%健钡缺晔段萌旱拇矶局辍@昧诮臃ǘ云浣方辛朔治觯嗬胨悴捎米畲蠛铣伤迫环āigure1.1 Evolutionary tree of the representative strains ofAsia-1(analysis by Mega7.0.26)Note: “○■▲●△%健眒eans of the representative strain of Group.The evolutionary history is

线路图,线路图,疫苗免疫,疫苗毒株


图 1.2 研究线路图Figure 1.2 Research line diagram1.3.2 主要内容1.3.2.1 研究经无血清悬浮培养的 Asia-1/HN/06 疫苗免疫失败原因疫苗免疫血清抗体效价测定,疫苗毒株序列分析。

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