饥饿对小鼠子宫颈上皮细胞中脂滴脂解和噬脂的影响

发布时间：2020-07-01 13:13

【摘要】：脂滴(LDs)是来自内质网的特殊的、复杂的、多功能的细胞器,几乎存在于所有类型的细胞中。随着现代科技的发展,人们对LDs的生化结构、蛋白组学、生理功能、代谢调节和与之相关的疾病有了越来越深入的了解。细胞中有两种分解LDs的途径:一是通过中性脂酶,如甘油三酯脂肪酶(ATGL)和激素敏感酯酶(HSL),来水解LDs中的甘油三酯(TG)和胆固醇酯(CE)等其他脂质;另一方面可以通过自噬来吞噬LDs,然后经自噬溶酶体内的溶解酶来降解其中的脂质。LDs的代谢异常和功能失调与肥胖症、脂肪肝、动脉粥硬化、Ⅱ型糖尿病、炎症和癌症等多种疾病存在着密切关系。子宫颈是连接着子宫体和阴道的重要通道。妊娠期间子宫颈的关闭保证了子宫内胎儿的正常发育。而分娩时子宫颈口的开张为足月胎儿的产出提供了保障。由于子宫颈口的开张和收缩都需要持续的能量供应,而提供能量的来源除糖原颗粒外,是否还由子宫颈上皮细胞中的LDs提供目前均尚不清楚,本研究旨在证明小鼠子宫颈上皮细胞(MCECs)中的LDs在饥饿状态下的能量代谢变化。首先,采集小鼠子宫颈腔上皮层并进行消化和分离,在DMEM/F12培养液中进行原代培养,利用免疫荧光的方法检测角蛋白的阳性率以证实上皮细胞的纯度,结果显示培养的MCECs纯度98%,符合实验要求。随后,用Hank’s平衡盐溶液(HBSS)替换DMEM/F12培养液来诱导饥饿,分别对MCECs进行饥饿处理0h、6h、12h和24h。利用荧光追踪法来检测细胞中LDs代谢的变化以及脂肪酸(FAs)在LDs和线粒体之间的转运状态。在饥饿处理前用Bodipy558/568(Red C12)标记FAs,然后开始对细胞进行饥饿处理,处理结束后分别用Bodipy493/503标记LDs和用MitoTracker Green标记线粒体(Mito),在共聚焦显微镜下观察FAs和LDs、FAs和Mito的位置关系。结果表明随着饥饿时间的延长,胞浆中的FAs含量逐渐增多,FA进入到线粒体中。同时,LDs数量增多,LDs变小(p0.05)。利用甘油三酯定量检测试剂盒检测饥饿处理后细胞中TG的含量,结果显示TG的量随饥饿时间延长显著减少(p0.05)。采用蛋白免疫印记技术检测与LDs代谢相关的酶类如ATGL和HSL、及其上游调控蛋白PKA和AMPK、和自噬标志蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达量变化。结果显示随着饥饿时间的延长,ATGL在6h时有显著上升(p0.05),但在24h时显著下降(p0.05),HSL和AMPK的表达量从12h时及以后都出现显著的下降(p0.05),PKA在饥饿6h时及以后出现显著的下降(p0.05),但LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达量只在24h时却显著升高(p0.05)。在使用H89(PKA抑制剂)后,结果发现ATGL和HSL表达量下降更加显著(p0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达量从6h时及以后更加显著升高(p0.05),而AMPK表达量变化不明显。用发光细胞活力检测试剂盒检测饥饿处理后的细胞中ATP量的变化,结果显示ATP的含量在饥饿6h时开始下降,从12h时及以后呈现显著降低(p0.05)。最后用流式细胞术检测线粒体膜电位的变化,结果表明线粒体膜电位随着饥饿时间延长呈现显著降低(p0.05),这意味着Mito受损程度越来越严重。总之,以上实验结果表明,随着饥饿时间的延长,由于上游调控中性脂酶表达的蛋白AMPK和PKA受到了抑制,ATGL和HSL的表达也受到抑制,PKA激活ATGL和HSL促进LDs的脂解作用减弱。但在这一过程MCECs中LDs内中性脂质仍在被分解,释放到胞浆中的游离FAs增多,同时LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达量在加强,这意味着此时自噬体在LDs分解代谢中发挥主要的作用。过多的FAs进入胞质会产生细胞毒性,造成线粒体膜电位下降,线粒体功能受损,进而导致ATP合成量减少。自噬体不仅参与脂滴的分解代谢,而且还清除FAs过量所引起的损伤细胞器。LDs分解代谢过程中产生的FAs并没有主要用来提供能量ATP。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.2
【图文】：

FAs 与 Mito 的荧光共定位关系 2 可以观察到：正常条件下，细胞中的 FAs 大多数聚集于 LDs 中。随着长，LDs 中有 FAs 释放出来进入到胞浆中。在共聚焦显微镜下可以看到 基本上共定位在 LDs 位置上，6h 和 12h 时候在 LDs 周围可见 FAs 荧光阳 FA 荧光阳性的区域更多。同时对 MCECs 细胞中的 LDs 数量和大小进行现 LDs 的大小是显著减小的（p<0.05），但是数量是显著增多的（p<0.05图 1. 角蛋白免疫荧光法观察原代细胞培养的 MCECsFig.1 Immunofluorescence of CK18 on MCECs

图 3 可以观察到：饥饿条件下，LDs 中释放出来的 FAs 一部分进入到线粒体中化为细胞提供能量，一部分游离在细胞质中。饥饿过程中，线粒体会向 LDs 的位置靠近，方便 LDs 释放的 FAs 迅速进入线同时线粒体会聚集到一起，进行融合，增加膜面积来促进β氧化的进行。随着时间的延长，6h 时候线粒体开始靠近 LDs 并在 LDs 周围聚集；12h 时候线粒合，产生的较大线粒体迅速代谢掉 LDs 释放的 FAs；然而 24h 时候由于释放的 产生的细胞毒性作用使线粒体受到破坏，部分 FAs 重新聚集到 LDs 中去，而产生的 LDs 都比较小，但是数量较多（图 3）。Fig.2 The change of the transfer of FAs and the number and size of LDsin starved MCECs

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本文编号：2736805