烟曲霉菌肺内定植对雏鸡先天性免疫以及禽流感抗体水平的影响

发布时间：2020-07-01 14:29

【摘要】：曲霉菌是广泛存在于自然环境中的一种腐生真菌,其中烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)和黄曲霉菌是引发禽曲霉菌病的常见致病菌,尤以烟曲霉菌的致病力最强。临床上,烟曲霉菌作为一种重要的条件性致病菌,通过向空气释放大量分生孢子(φ≈2-3μm)的方式传播病原,这些分生孢子被宿主吸入支气管和肺泡后可以引起严重的呼吸系统疾病,对家禽的危害尤为严重,尤其是对霉菌较为敏感的雏鸡。已有文献报道在畜禽舍的微生物气溶胶中含有一定浓度的气载真菌。当空气中少量的烟曲霉菌分生孢子被雏鸡吸入时可能不会引起感染,但这部分被吸入的分生孢子是否可以在肺内定植?定植后是否可以引起肺组织局部的先天性免疫应答?以及是否对禽流感(AI)抗体形成影响?而目前的研究主要报道家禽感染烟曲霉菌的防治与诊断,对雏鸡定植烟曲霉菌的先天性免疫应答以及对AIV感染的免疫影响还有待研究。基于此,为了研究烟曲霉菌肺内定植对雏鸡肺部先天性免疫以及AI抗体水平的影响,本课题建立了烟曲霉菌雏鸡肺部定植模型。本课题选用了200羽9日龄SPF雏鸡为试验动物并随机分为6组:空白对照组(A)、烟曲霉菌定植组(B)、H9N2 AIV感染组(C)、烟曲霉菌定植+H9N2 AIV感染组(D)、AI疫苗免疫组(E)、AI疫苗免疫+烟曲霉菌定植组(F)。9日龄和23日龄时对E、F组的雏鸡颈部皮下接种0.2 mL H9亚型AI疫苗;14日龄时B、D、F组接种烟曲霉菌琼脂珠,A组以0.3 mL生理盐水代替;17日龄时C、D组通过点眼滴鼻方式接种0.2 mL H9N2 AIV。通过六胺银(GMS)染色、真菌培养和镜检的方法确定B组的雏鸡是否成功定植烟曲霉菌;利用qRT-PCR方法检测A、B组雏鸡接种烟曲霉菌琼脂珠后第1、3、5、7天肺、脾组织中TLRs(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4)和细胞因子(IL4、IL6、IFN-α、IFN-β、TNF-α)的mRNA的表达;通过转录组测序技术检测A、B组雏鸡接种烟曲霉菌琼脂珠后第2天肺组织的转录组表达,并利用qRT-PCR方法对转录组测序结果中部分先天性免疫因子(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、IL-1β、IL6、IL8、IL10、IFN-α、IFN-β、IFN-γ)进行验证;利用HA和HI实验检测C、D组和E、F组的禽流感抗体效价;利用qRT-PCR方法检测C、D组雏鸡肺、脾组织中先天性免疫因子(TLR3、TLR7、IL-1β、IL4、IFN-α、IFN-γ)的mRNA表达。结果显示:雏鸡肺内接种0.3 mL浓度为5×10~6 CFU/mL的烟曲霉菌琼脂珠可以使烟曲霉菌定植在雏鸡肺内,且定植时间为28天;在接种烟曲霉菌琼脂珠后第1、3、5、7天B组雏鸡相对于A组雏鸡的肺、脾组织中TLR1、TLR4整体下调表达,TLR3整体上调表达,TLR2的表达量整体较低,促炎细胞因子IL6在肺组织中下调表达,脾脏中上调表达,TNF-α在第3、5天上调表达,IFN-α、IFN-β在肺、脾组织中整体上调表达,IL4在第1、3天上调表达;转录组测序共鉴定的基因总数是17,732个,其中980个差异表达基因(p0.05,倍变1.0或以上),上调基因767个,下调基因213个。KEGG生物通路的免疫系统差异表达基因107个;C组和D组雏鸡的AI抗体效价在试验期间趋势基本一致,差异不显著(p0.05),E组和F组雏鸡的AI抗体效价差异也不显著(p0.05);D组雏鸡肺、脾组织内TLR3、TLR7、IL-1β、IL4、IFN-α的mRNA表达水平普遍高于C组雏鸡。本研究表明:本课题成功建立了雏鸡肺部烟曲霉菌定植模型;烟曲霉菌定植后引起肺组织mRNA差异表达,激活了先天性免疫因子引起肺组织局部的免疫应答;烟曲霉菌和AIV具有协同作用,能够激活雏鸡的先天性免疫因子,但对AI抗体水平的影响不显著。总之,本研究成功地建立了雏鸡肺部烟曲霉菌定植模型,并对烟曲霉菌定植雏鸡的肺组织进行了转录组测序分析,初步研究了雏鸡烟曲霉菌定植的先天性免疫反应以及对AI抗体水平的影响,为进一步探讨烟曲霉菌与禽宿主之间的相互作用以及对其他病原菌的影响奠定了基础。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.31
【图文】：

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图 1 雏鸡接种烟曲霉菌琼脂珠后肺的剖检病变Fig. 1 Anatomical changes of lung in chickens inoculated with A.fumigatus agar beads注：图 A、B 是 D 组第 5、7 天死亡雏鸡的肺组织，C、D、E、F 分别为 B 组第 1、3、7、10 天雏鸡的肺组织为 A 组雏鸡的肺组织。Note: Figs A and B showed lung tissues of chickens died on the 5th and 7th day in group D. CD, E and F were lung tissues of group B chickens on day 1, 3, 7 and 10, respectively. G was the lung tissue of group Achickens. 雏鸡肺组织真菌培养形态学无菌研磨肺组织后，在 PDA 培养基中培养，我们发现菌落初始是白色绒毛状，2~转为绿色，数日后变为深绿色，呈粉末状（图 2A、B）。显微镜下可见培养物的分子的顶囊呈烧瓶状，小梗单层颜色为深绿色，直径约 22 μm，分生孢子梗小于 300 μm 2C）。由此见在接种烟曲霉菌琼脂珠的雏鸡肺组织中可以培养大量的烟曲霉菌，第 28 天烟曲霉菌逐渐被肺组织清除（图 2D）。通过肺组织切片的 GMS 染色可以染成黑色的烟曲霉菌丝（图 2E）。通过肺组织真菌培养和 GMS 染色，我们确定雏

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图 2 雏鸡肺组织在 PDA 培养基的生长与鉴定Fig. 2 Growth and Certification of Chicken Lung in PDA Medium注：图 A、B、D 是 B 组肺组织在 PDA 培养基上不同时间点的状态，图 C 是显微镜下 B 组培养物的形态，图 E是 B 组肺组织切片的 GMS 染色，图 F 是 A 组肺组织切片的 GMS 染色。Note: Fig A, B and D are the states of lung tissuein group B at different time points on PDA medium. Fig C is the morphology of lung tissue in group B under microscope. FigE is the result of GMS staining of lung tissue slices in group B. Fig F is the result of GMS staining of lung tissue slices ingroup A.3.4 q RT-PCR 检测雏鸡定植烟曲霉菌后先天性免疫相关因子的表达3.4.1 q RT-PCR 检测雏鸡定植烟曲霉菌后 TLRs 的表达在雏鸡接种烟曲霉菌后的第 1、3、5、7 天随机挑选接种烟曲霉菌和健康的雏鸡各 3羽处死，取出脾脏与肺组织用于 qRT-PCR 检测 TLRs 的表达。

【参考文献】