禽白血病病毒衣壳蛋白p27免疫抑制作用机理的初步研究

发布时间：2020-07-01 15:15

【摘要】：禽白血病病毒(ALV)自从1989年报道以来,给世界养禽业带来了严重的危害。该病可使感染鸡群产蛋量下降、继发或/和混合感染多种疾病,引起鸡群的死淘率上升,免疫抑制增强,以及多种类型的肿瘤,损失重大。该病到目前为止还没有有效的疫苗和治疗方法。p27蛋白(ALV-p27)是病毒编码的群特异性衣壳蛋白,在病毒中含量高,有许多易于检测的抗原位点,常被用于ELISA和免疫荧光的检测。有研究表明p27可以影响一些细胞因子的表达,提示ALV-p27可能在病毒感染引起的免疫抑制中发挥一定的作用。为了明确p27对免疫的影响,本研究在构建pcDNA3.1-p27全长真核表达载体,以及p27分段表达载体的基础上,探究p27蛋白的免疫抑制机理。1.ALV-p27抑制DF-1细胞对LPS和Poly(I:C)的刺激为了研究在LPS和Poly(I:C)刺激后,过表达的ALV-p27在DF-1细胞中产生的免疫抑制作用,本研究利用实验室已构建的pcDNA3.1-p27真核表达载体为模板,并成功克隆构建了 p27的两个分段表达载体pcDNA3.1-p27A(1-480bp)和pcDNA3.1-p27B(241-720bp)。将全长的p27质粒和空载体质粒分别转染DF-1细胞中,随后用LPS和Poly(I:C)刺激物刺激,分别在1,6,12和24h收集细胞,提取RNA,利用Real-timePCR检测IL-1β、IL-6、IFN-β等细胞因子的表达情况。结果表明,DF-1细胞中过表达的p27蛋白显著影响免疫相关细胞因子的表达。进一步研究发现,分段表达载体pcDNA3.1-p27A(1-480bp)和 pcDNA3.1-p27B 转染的 DF-1 细胞中,pcDNA3.1-p27B 具有抑制细胞因子表达的作用,提示p27蛋白发挥免疫抑制作用的位点位于480-720bp,即蛋白C端。这一结果说明ALV-p27蛋白可能通过抑制细胞因子的表达抑制机体的免疫反应。2.ALV-p27抑制DF-1细胞免疫反应机理的初步研究为了进一步探讨ALV-p27在DF-1细胞中产生免疫抑制作用的相关机理,利用Real-time PCR的方法检测了 LPS和Poly(I:C)刺激细胞后,相关信号通路途径的一些关键分子的基因表达,结果表明,LPS刺激后,其信号通路中的IRAK4和IRF-7基因表达受到明显抑制;而Poly(I:C)刺激后,基因水平上该信号通路的常见分子未发生显著变化。利用双荧光酶报告系统进一步研究发现,Poly(I:C)刺激后,p27蛋白可通过抑制IFN-β基因表达的启动子抑制基因表达;LPS刺激后可抑制IRF-7的启动子活性产生免疫抑制作用;而MAPK相关信号通路分子蛋白磷酸化实验结果表明,LPS和Poly(I:C)刺激后,p27蛋白明显抑制p38蛋白的磷酸化水平从而抑制下游基因的表达。以上实验结果表明,ALV-p27可能通过抑制信号通路相关基因分子表达、抑制细胞因子表达的启动以及影响信号通路关键蛋白的磷酸化发挥免疫抑制作用。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

（ＩＲＡＫ）与死亡结构域相结合，从而连接Ｔｏｌｌ样受体与下游的蛋白激酶，进行信号逡逑ＭｙＤ８８和ＴＲＡＦ６还可以结合ＩＲＦ－７，并募集ＩＲＡＫＩ磷酸化的ＩＲＦ－７，导致核易位。逡逑８是通过募集一些关键的蛋白复合物或家族（如ＩＲＡＫＩ、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４等）来完逡逑转导的，这些蛋白家族的５’端有一个可以与ＭｙＤ８８死亡结构域相结合的死亡结构逡逑’端是丝氨酸／苏氨酸激酶结构域［３５１。首先，ＭｙＤ８８与ＩＲＡＫ４形成复合物，其次，被逡逑的ＩＲＡＫＩ和ＩＲＡＫ２形成复合体，并与ＴＲＡＦ６相互作用，接着ＴＲＡＦ６结合Ｅ２泛逡逑酶，泛素化修饰ＩＲＡＫＩ和ＴＲＡＦ６，导致ＴＡＫ１的激活＠１。进而激活ＭＡＰ和ＮＦ－ｋＢ逡逑从而导致趋化因子、Ｉ型干扰素、细胞因子的转录和翻译。□非ＭｙＤ８８依赖途径，逡逑的转导是因为巨噬细胞被ＴＬＲ３和ＴＬＲ４的ＰＡＭＰＳ刺激产生的。非依赖途径的机制逡逑依赖途径，通过募集ＲＩＰ１和ＴＲＡＦ６到ＴＲＩＦ的特定区域，使其相互作用后激活ＴＢＫ１。逡逑Ｅ３连接酶－ＮＲＤＰ１的调节这两个途径，避免病毒入侵后炎症因子过多而导致机体损逡逑邋ＴＲＡＦ３同样在这两个途径中起关键作用，ＴＲＡＦ３的泛素化是非依赖途径产生［型逡逑的必要组成部分，同时，它的泛素化降解可以促进依赖途径中细胞因子的表达［３８１。逡逑

－－１８Ｓ逡逑Ｒ邋５，－ＴＴＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＡＡＧＴＴ－３，逡逑１．５禽白血病衣壳蛋白ｐ２７真核表达载体的构建逡逑将实验室己经构建好的ｐｃＤＮＡ３．１－ｐ２７质粒用ＢａｍＨ邋Ｉ和Ｘｈｏ邋Ｉ进行双酶切，鉴定正确的阳性克隆质粒送南京金斯瑞生物有限公司进行测序。设计带有ｆｌａｇ标分段表达的引物ｌ－４８０（ｐ２７Ａ段），２４１？７２０（ｐ２７Ｂ段）见图１，ＰＣＲ扩增引物序列如线分别为ＢａｍＨ邋Ｉ和Ｘｈｏ邋Ｉ酶切位点：逡逑ｐ２７Ａ：邋Ｆ：邋ＧＣＧＧＡＴＣＣａｔｇｃｃｔｇｔａｇｔｇａｔｔａａｇ逡逑Ｒ：邋ＧＣＣＩＣＧＡＧＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣｔｃｃｃｔｇｃｇｔａａｔｇｔｃｃｇｃ逡逑ｐ２７Ｂ：邋Ｆ：ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧｇｔｔａｔａｇｃｇｇｃａｇｃｃａｃｔ，逡逑Ｒ：ＧＣＣＩＣＧＡＧＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣｇｇｃｃｇｃｇｇｃｔａｔｇｃｃｔｔｇ逡逑ＰＣＲ邋程序：９５邋°Ｃ预变性邋５ｍｉｎ，然后邋９４°Ｃ邋ｌｍｉｎ，５２°Ｃ３０ｓ，７２°Ｃｌｍｉｎ，３５邋７２０Ｃ７ｍｉｎ，４°Ｃ循环。逡逑

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本文编号：2736929