海藻多糖对仔猪小肠上皮细胞屏障功能的调控作用

发布时间：2020-07-01 21:38

【摘要】：本试验以仔猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)为研究对象,阐述海藻多糖对IPEC-J2细胞屏障功能的调节作用及可能机制,研究结果可为海藻提取物在畜牧生产中的应用提供一定的理论依据和参考。试验一海藻多糖对仔猪小肠上皮细胞毒性、凋亡和增殖的影响本试验以仔猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)为模型,旨在研究海藻多糖对IPEC-J2细胞毒性、凋亡和增殖的影响。试验选取不同浓度的海藻多糖,测定其对IPEC-J2细胞活力和LDH释放率的影响,筛选出海藻多糖的适宜添加剂量和作用时间,在此基础上,通过流式细胞术测定海藻多糖对IPEC-J2细胞凋亡和增殖的影响。试验结果表明:(1)当海藻多糖处理IPEC-J2细胞12 h时,添加浓度范围为8-480μg/mL的海藻多糖可以显著促进IPEC-J2细胞的活力(P0.05)。当海藻多糖处理24 h浓度为60μg/mL、120μg/mL和240μg/mL时,显著促进IPEC-J2细胞的活力,且在240μg/mL处达到最大值,当浓度大于240μg/mL时,细胞的活力开始出现下降趋势。同时在30-7680μg/mL这一范围显著降低LDH的释放率(P0.05)。因此本试验选取60μg/mL、120μg/mL和240μg/mL这一浓度范围用于后续的试验处理。(2)与对照组相比,添加海藻多糖60μg/mL、120μg/mL和240μg/mL组均显著地降低细胞的凋亡数量(P0.05),120μg/mL和240μg/mL海藻多糖组显著促进细胞的增殖分裂(P0.05)。综上所述,海藻多糖可降低IPEC-J2细胞毒性和凋亡,促进IPEC-J2细胞增殖。试验二海藻多糖对仔猪小肠上皮细胞屏障功能的调节作用本试验通过测定紧密连接蛋白、炎症因子和NF-κB信号通路相关基因的表达,探讨添加60μg/mL、120μg/mL和240μg/mL的海藻多糖对IPEC-J2细胞机械屏障和免疫屏障功能的调控作用。试验结果发现:(1)与对照组相比,60μg/mL和120μg/mL的海藻多糖组可显著的上调IPEC-J2细胞紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的mRNA表达(P0.05),120μg/mL和240μg/mL海藻多糖显著上调紧密连接蛋白Claudin-1的mRNA表达(P0.05)。同时,添加海藻多糖对Occludin蛋白的表达无显著影响(P0.05),,添加120μg/mL和240μg/mL的海藻多糖可以显著上调IPEC-J2细胞紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1的表达(P0.05)。(2)与对照组相比,添加240μg/mL海藻多糖显著下调了TLR-4和IκBα的mRNA表达(P0.05),60μg/mL、120μg/mL和240μg/mL的海藻多糖显著的下调了MyD88和p65的mRNA表达(P0.05),但对p65、p-p65和p-p65/p65的蛋白表达没有显著差异(P0.05),对细胞上清中炎症因子IL-6和TNF-α的表达没有显著影响(P0.05)。综上可知,添加海藻多糖24 h可以促进IPEC-J2细胞紧密连接蛋白的表达,下调NF-κB信号通路相关基因表达,但对细胞因子的分泌没有显著影响。试验三海藻多糖对大肠杆菌感染仔猪小肠上皮细胞后损伤的修复效应研究本试验旨在通过海藻多糖处理IPEC-J2细胞24 h后,对大肠杆菌感染IPEC-J2细胞后的通透性,粘附入侵数活菌数,紧密连接蛋白的表达量以及NF-κB通路相关基因表达的影响,阐述海藻多糖对大肠杆菌感染IPEC-J2细胞的后损伤的修复效应研究。试验结果表明:(1)当大肠杆菌感染90 min时,240μg/mL的海藻多糖可以显著的缓解由大肠杆菌感染引起的IPEC-J2细胞的通透性下降,大肠杆菌感染120 min时,添加60μg/mL、120μg/mL和240μg/mL海藻多糖组均可以显著缓解由大肠杆菌感染引起的IPEC-J2细胞通透性下降,且具有剂量效应趋势(P0.05)。(2)大肠杆菌感染显著降低IPEC-J2细胞紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1的mRNA表达,但添加海藻多糖预处理后,显著抑制大肠杆菌感染引起IPEC-J2细胞紧密连接蛋白相关基因表达下降(P0.05)。大肠杆菌感染2 h后可降低紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1的蛋白表达,但是差异并不显著。大肠杆菌感染4 h后,显著的降低紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的蛋白表达,但对紧密连接蛋白ZO-1的表达无显著影响,与大肠杆菌感染组相比,60μg/mL、120μg/m L和240μg/mL海藻多糖显著的缓解了由大肠杆菌感染引起的IPEC-J2细胞紧密连接蛋白Occludin的蛋白表达下降(P0.05),240μg/mL的海藻多糖显著缓解了大肠杆菌感染引起的IPEC-J2细胞紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1的表达量的下降(P0.05)。(3)当大肠杆菌感染2 h时,相对于大肠杆菌感染组,60μg/mL、120μg/mL和240μg/mL的海藻多糖组可显著的促进IPEC-J2细胞上清中炎症因子IL-6和TNF-α的表达(P0.05),当大肠杆菌感染4 h时,相对于大肠杆菌感染组,60μg/mL、120μg/mL和240μg/mL的海藻多糖可以显著的抑制IPEC-J2细胞上清液中炎症因子TNF-α和IL-6的表达(P0.05)。(4)海藻多糖对大肠杆菌的活力具有抑制作用,120μg/mL和240μg/mL的海藻多糖能够降低大肠杆菌的活菌数,减少大肠杆菌对IPEC-J2细胞的粘附和入侵活菌数(P0.05)。综上所述,添加海藻多糖可以显著缓解大肠杆菌感染对IPEC-J2细胞紧密连接蛋白的破坏,当大肠杆菌感染2 h时,海藻多糖对IPEC-J2细胞呈促炎作用,当大肠杆菌感染4 h时,海藻多糖IPEC-J2细胞呈抑炎作用,同时海藻多糖可以降低大肠杆菌的活力,减少大肠杆菌对IPEC-J2细胞的粘附和入侵的活菌数。
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S828.5
【图文】：

链接,复合物

图 1.1 紧密链接复合物Fig. 1.1 tight junction complex注：引自 Susana Lechuga（2017）[30]2.1.1 Occludin 蛋白Occludin 又称为咬合蛋白，是最早被发现和研究最多的紧密连接蛋白，其分子量大小约为 59 kDa，Occludin 蛋白由四个跨膜结构域组成，分别是细胞外环和胞内结构域。两个细胞外环都富含酪氨酸残基，超过一半的残基是酪氨酸和甘氨酸[31]。氨基酸磷酸化是影响紧密连接蛋白 Occludin 发挥屏障功能的关键，尤其是丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化。Occludin 胞内羧基末端的最后 150 个氨基酸可以直接与肌动蛋白相互作用，共同介导肠道的屏障功能，这是其他紧密连接蛋白所不具有的特性。Occludin 也能够通过这个羧基段直接与蛋白 ZO-1、ZO-2 和 ZO-3 相互连接[32]。多胺类化合物对 Occludin 合成起着至关重要的作用，多胺的缺乏显著的影响到紧密连接

信号通路,图片

海藻多糖对仔猪小肠上皮细胞屏障功能的调控作用炎症是一种普遍存在的应激反应，抗原受体、先天免疫系统的受体和某些细胞应激都可以引起 NF-κB 信号通路的激活。NF-κB/Rel 复合体包括 5 个亚单位，NF-κB2p52/p100、NF-κB1 p50/p105、c-Rel、RelA/p65 和 RelB。NF-κB 家族转录因子包括促炎和抗凋亡基因转录程序的关键调控因子，在宿主免疫反应的发应和协调中扮演着重要的共稳态角色。过度激活则会产生持续的炎症反应，从而引起机体的恶性肿瘤[55]。

【参考文献】