【摘要】：鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭的一种急性、高致死性传染病,发病急,传播迅速,病程短和死亡率高;临床表现为角弓反张,剖检见肝肿大和大量的出血性斑点,主要通过接触传播,经呼吸道亦可感染。DHV分为3个血清型,即1型(DHV-1)、2型(DHV-2)和3型(DHV-3),其中DHV-1是主要血清型。该病是危害养鸭业最为严重的传染病之一,在全国范围内都有不同程度的流行和发生,疫情较难控制,虽然鸭肝炎弱毒苗和灭活苗已在全国范围内大面积推广,但在实际生产过程中,免疫效果并不理想,鸭肝炎仍时有暴发,给养鸭业带来严重危害,对于该病的控制仍旧得不到显著改善。本研究通过对DHV-1 VP1基因的扩增,构建重组表达质粒,将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达,获得重组VP1蛋白表达产物;同时利用噬菌体展示技术以重组DHV-1 VP1蛋白为靶蛋白,通过噬菌体随机12肽库筛选,结合ELISA鉴定和竞争抑制试验,筛选到能与其特异性结合的多肽;以重组融合肽TP5-BP5(TBP5)配合DHV-1 VP1蛋白基因工程亚单位疫苗进行雏鸭动物免疫实验,探讨其对DHV-1 VP1蛋白亚单位疫苗的免疫增强作用。主要试验内容分为以下三个方面:1、DHV-1 VP1基因的克隆及表达通过引物F1和F2对DHV-1 VP1基因进行RT-PCR扩增,产物经过琼脂糖凝胶电泳后得到约714 bp大小条带,克隆到pET-32a载体,筛选重组表达质粒,经EcoR I与Xba I双酶切和PCR进行鉴定,获得重组表达质粒pET32aVP1,并将重组质粒pET32a-VP1转化至E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,pET-32a(+)-VP1诱导后表达约43.0KD大小的目的蛋白条带(包含TRX硫氧还蛋白),表明DHV-1 VP1基因在大肠杆菌中获得了表达。Western-blot分析结果显示,在43.0KD处可见特异性条带,与预期结果一致,本研究为DHV-1VP1蛋白基因工程亚单位疫苗的制备提供实验材料。2、DHV-1 VP1蛋白特异性结合肽的筛选利用噬菌体展示技术,并以DHV-1 VP1蛋白作为靶标对噬菌体随机12肽库进行3轮亲和筛选,获得20个单个噬菌体克隆,结合ELISA鉴定和竞争抑制试验,获得与DHV-1 VP1蛋白特异性结合的阳性噬菌体克隆P4与P6,提取其DNA进行序列测定,结果显示2个噬菌体阳性克隆插入的12肽氨基酸序列分别为,P4-12:LLSPGTHHSPWP;P6-12:LLADTTHHRPWT,分析其保守序列为THHXPW。通过MTT法分析获得DHV-1 VP1蛋白结合肽P4-12与P6-12本身对鸭胚成纤维细胞的增殖均无明显影响,通过测定病毒滴度和病毒拷贝数结果表明P4-12和P6-12均能显著降低鸭胚成纤维细胞中的DHV-1病毒滴度和病毒拷贝数,表明多肽P4-12和P6-12显著抑制DHV-1在鸭胚成纤维细胞中的增殖,为进一步探明DHV-1与宿主细胞的相互作用以及抗病毒制剂开发提供了实验线索。3、重组融合肽TBP5对DHV-1 VP1蛋白亚单位疫苗的免疫增强作用将重组融合肽TBP5配合DHV-1 VP1蛋白亚单位疫苗,通过雏鸭的分组和免疫,通过检测鸭体内血清IgG抗体、血清细胞因子(INF-γ、IL-4)水平、动物免疫保护试验及HE染色来评价重组融合肽TBP5对DHV-1 VP1蛋白亚单位疫苗的免疫增强作用。结果显示,重组融合肽TBP5配合DHV-1 VP1蛋白亚单位疫苗组雏鸭血清IgG抗体水平、细胞因子(IL-4、IFN-γ)水平均显著高于对照组与疫苗组。动物免疫保护试验结果显示,重组融合肽TBP5配合DHV-1VP1蛋白亚单位疫苗免疫雏鸭后增强了对肝脏的保护作用,以上结果表明,重组融合肽TBP5对DHV-1 VP1蛋白亚单位疫苗具有免疫增强作用,为DHV-1VP1蛋白亚单位疫苗的新型佐剂研究奠定基础。
【学位授予单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.32
【图文】：
图 2-1 DHV-1VP1 基因扩增结果Figure 2-1 PCR amplification of DHV-1VP1 gen2：DHV-1 VP1 基因的 PCR 扩增产物；3：pET3双酶切；4：DL 15000 Marker ； 克隆质粒的构建ET32a-VP1 转入 E. coli BL 21(DE3)中进行诱分析后，可见重组表达载体 pET32a-VP1白条带，与预期结果相同（图 2-2）。
图 2-2 DHV-1VP1 在大肠杆菌中的表达Fig. 2-2 Expression of DHV-1 VP1 gene in E. coli BL2ker；2：大肠杆菌 BL21(重组质粒 pET32a-VP1)诱ET32a)诱导表达产物；4：重组 VP1 蛋白 Westera)诱导表达产物 Western-blot，是由鸭肝炎病毒（DHV）引起雏鸭肝脏以传播速度快，死亡率高为特征。本病的发，死亡率高达 95%；1-3 周龄的雏鸭的死亡精神萎靡，没有食欲，眼半闭呈昏迷状，腹现神经症状，运动失调，行走困难；并且使和股部皮下水肿，绒尿液增多等症状，给
【参考文献】
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本文编号：
2739001
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