传染性法氏囊病病毒感染时宿主蛋白FKBP12的应答检测及其抗病毒作用

发布时间：2020-07-03 15:13

【摘要】：鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的禽免疫抑制病。IBDV靶向攻击鸡的中枢免疫器官法氏囊,破坏核心免疫细胞B淋巴细胞,不仅直接造成鸡只死亡,耐过鸡还呈现严重免疫抑制,降低机体免疫力,引起严重的并发和继发感染,严重危害养禽业的健康发展。IBDV是一种具有双节段双链RNA基因组(A节段和B节段)的二十面体病毒。B节段编码具有RNA依赖的RNA聚合酶活性(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)的VP1蛋白。A节段包含两个部分重叠的开放阅读框(Open reading frame,ORF),小ORF编码VP5,大ORF编码一个多聚蛋白(Polyprotein,PP)前体pVP2-VP4-VP3,该蛋白可被VP4反式酶解而释放出pVP2和VP3,pVP2进一步成熟为VP2。IBDV感染过程中,宿主天然免疫发挥重要的调控作用。FK506结合蛋白12(FK506 binding protein 12,FKBP12)是FKBPs家族的重要成员,具有肽基脯氨酰顺反异构酶(Peptidyl-proly cis-trans isomerases,PPIase)活性等多种生理功能,也参与几种人源病毒的感染调控。本实验室前期的iTRAQ检测数据提示,宿主FKBP12在IBDV感染时有明显调动。本研究建立了宿主FKBP12荧光定量RT-PCR检测方法,利用不同毒力的多种IBDV参考毒株,以SPF鸡、DT40细胞为感染模型,从体内、外两个层面研究IBDV感染时宿主FKBP12的应答性变化。体、内外检测结果均表明,FKBP12在IBDV强毒感染时下调,弱毒感染时上调。这提示,FKBP12在IBDV感染过程中可能发挥重要调控作用。为证实这一推测,本研究分别运用过表达和siRNA干扰技术上调和下调FKBP12表达,从基因转录水平、蛋白表达水平以及病毒滴度三个层面评估FKBP12对IBDV复制的影响。结果表明,FKBP12上调表达抑制IBDV复制,下调表达促进病毒复制。这证明,FKBP12是IBDV感染的一个宿主限制性因子。为探索宿主FKBP12作为IBDV宿主限制性因子的作用分子细节,本研究进一步通过GST pull down和激光共聚焦试验证实了鸡源FKBP12与IBDV VP4蛋白存在相互作用。鉴于这两个互作蛋白分别具有PPIase活性和丝氨酸蛋白酶活性,我们推测,FKBP12可能会通过影响VP4酶活性进而抑制IBDV的复制。基于IBDV多聚蛋白(PP)被VP4反式酶解的研究模型,研究发现,FKBP12过表达会抑制IBDV VP4蛋白对病毒PP蛋白的反式酶解,具体体现在源自PP酶解的VP2和VP3的下调。这说明,宿主FKBP12对IBDV的VP4反式酶解活性具有抑制作用。本研究从基因转录、蛋白表达、病毒滴度三个层面检测了宿主蛋白FKBP12对IBDV复制的影响,鉴定了FKBP12是IBDV的一个新的宿主限制性因子。建立了宿主FKBP12荧光定量RT-PCR检测方法,检测了FKBP12在IBDV感染时的应答变化:IBDV弱毒感染时,宿主限制性因子FKBP12被(宿主)上调;IBDV强毒感染时,宿主限制性因子FKBP12被(病毒)下调。证明了宿主FKBP12与IBDV VP4蛋白存在相互作用,初步揭示了FKBP12通过抑制VP4反式酶解病毒多聚蛋白的蛋白酶活性进而发挥宿主限制因子的作用。本研究对于探索IBD防控新制剂和新策略具有重要意义。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.31
【图文】：

鸡源,序列比对

基因克隆；B，序列比对A, Gene cloning; B, Sequence analysis图 2.1 鸡源 FKBP12 基因的克隆及序列比对g. 2.1 Gene cloning and sequence analysis of chicken FKBP12因 RT-qPCR 检测方法的建立片段（bp 81-261）克隆入 pMD18-T 载体，成功构质粒 pT-FKBP12-S。提纯后，其浓度为 185.74 ng/ FKBP12 RT-qPCR 检测方法的条件参数进行优化荧光染料 10 μL，样品 cDNA 2 μL，引物 FKBP去离子水补足至 20 μL。同时设置阴性对照（去离子8 ℃ 20s，72 ℃ 20s，45 个循环。溶解曲线程序为：粒检测结果建立的标准曲线斜率为-3.33，截距为，RT-qPCR 检测反应体系中标准质粒拷贝数为 6

标准曲线,鸡源,基因,强毒感染

14A，标准曲线；B，敏感性分析；C，特异性分析A, Standard curves; B, Sensitivity analysis; C, Specificity analysis图 2.2 鸡源 FKBP12 基因荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立Fig. 2.2 Establishment of a fluorescence quantitative RT-PCR assay for chicken FKBP12 g 感染对宿主 FKBP12 影响的体内检测结果不同强毒感染对 FKBP12 影响的体内检测结果试验一中， vvIBDV 中国参考株 HLJ0504、HuB-1、vvIBDV 欧洲参考株型致病性。与对照组相比，三个感染组均在感染后 48h（h p.i.）开始发病法氏囊开始萎缩。RT-qPCR 检测结果显示，与对照组相比，在 48h p.i.和 7导致 FKBP12 下调（图 2.3）。

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