牛源多杀性巴氏杆菌感染小鼠肺组织的转录组学分析

发布时间：2020-07-03 20:53

【摘要】：多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是一种革兰阴性条件致病菌,可感染多种家养或者野生动物;根据荚膜抗原的特异性,可将其分为A、B、D、E和F 5个血清型。在我国牛群中,以往流行的主要是B型多杀性巴氏杆菌造成的出血性败血症;而自2006年以来,则主要是A型多杀性巴氏杆菌造成的多杀性巴氏杆菌肺炎,该病不仅严重威胁动物健康,也给我国养殖业带来较大的经济损失。近年来,有文献报道多杀性巴氏杆菌可以引起宿主的炎性介质以及细胞凋亡等方面的免疫学改变,以及添加氨基酸,如谷氨酰胺(Gln)、脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)等,可增强宿主抵抗多杀性巴氏杆菌感染的能力。但到目前为止,对牛源A型多杀性巴氏杆菌致病机制及其与宿主相互作用机制尚不清楚。因此,为了研究多杀性巴氏杆菌-宿主相互作用机制,本研究首先利用LD_(50) A型多杀性巴氏杆菌(PmCQ2)感染小鼠,建立小鼠多杀性巴氏杆菌肺炎模型;然后,利用转录组测序技术对感染组与未感染组的小鼠肺组织进行转录组测序;同时,利用GO注释与KEGG数据库对测序结果中的差异表达基因(DEGs)进行分析与注释,从宿主免疫反应和氨基酸代谢角度分析DEGs所在富集通路并进行验证,旨在了解多杀性巴氏杆菌感染小鼠后,其肺组织中的免疫学变化及氨基酸代谢变化,为研究多杀性巴氏杆菌与宿主之间的相互作用机制奠定基础。1.小鼠多杀性巴氏杆菌肺炎模型的建立为了建立多杀性巴氏杆菌肺炎模型,本研究利用LD_(50) A型多杀性巴氏杆菌(PmCQ2)腹腔注射小鼠,观察小鼠死亡情况;同时,利用荧光原位杂交(FISH)及梯度稀释涂板检测感染0h、8h、16h、24h时肺部细菌定殖量;利用HE染色检测肺组织炎性病理变化。结果显示,PmCQ2对小鼠具有高致死性;通过稀释涂板发现肺组织中细菌定殖量随时间呈显著性上升趋势;通过FISH试验发现PmCQ2感染16h和24h时,切片红色荧光信号显著性强于8h,但16h时的红色荧光信号最强;通过HE染色观察发现,PmCQ2引起小鼠肺组织强烈的炎性病变,主要表现为大量的以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润。以上结果提示,由PmCQ2感染引起的小鼠多杀性巴氏杆菌肺炎模型建立成功。2.小鼠肺组织转录组测序以及质量评估为了探索多杀性巴氏杆菌-宿主相互作用机制,本研究利用转录组测序技术对PmCQ2感染组与未感染组的小鼠肺组织进行转录组测序;利用NGS QC Toolkit和Bowtie2或者Tophat(http://tophat.cbcb.umd.edu/)进行质控检测及来样本评估。结果显示,clean reads数目可达5×10~7-7×10~7,有效碱基的百分比均在95%以上,基因组比对率基本在85%以上,GC含量均在49.5%-50.5%之间。以上结果提示,本研究中的转录组测序质量可信。3.从宿主免疫反应角度分析及验证3.1 Th1、Th17通路中DEGs具有明显的富集性为了探究PmCQ2感染后小鼠肺组织中的免疫反应,本研究分析从测序中DEGs在免疫反应(Th1、Th2、Th17)中的富集情况。结果显示,DEGs在Th1和Th17信号通路中呈明显的富集性,并且大多在感染后呈显著性上调。3.2 PmCQ2感染主要引起小鼠肺组织产生Th1免疫反应为了进一步验证转录组结果中Th1和Th17通路的富集性,本研究利用qRT-PCR验证Th1和Th17通路中的相关DEGs(Il6、Il23、Il17、Ifnγ和Tnfα);利用ELISA进一步检测IL6、IL17和IFNγ的分泌;利用western-blot检测Th1和Th17信号转导中起关键调节作用的转录因子STAT1~(Tyr701)和STAT3~(Tyr705)的磷酸化水平。结果显示,Th1和Th17通路中的相关细胞因子在感染后呈显著性上调,该结果与转录组测序结果一致;并且,通路中关键细胞因子IL6、IL17和IFNγ在感染后也均呈显著性上升;western-blot检测到p-STAT1~(Tyr701)在PmCQ2感染后呈显著性上升,p-STAT3~(Tyr705)在感染后有上升趋势但不显著。以上结果提示,经多杀性巴氏杆菌感染后,小鼠肺组织中产生了强烈的Th1反应,而Th17反应可能也有参与,但还需进一步探究。4.从宿主氨基酸代谢角度分析及验证4.1多种氨基酸代谢通路中DEGs具有明显的富集性为了探究宿主氨基酸代谢与多杀性巴氏杆菌感染的相关性,本研究分析测序中DEGs在氨基酸代谢通路中的富集程度;利用qRT-PCR验证富集通路中的关键DEGs。结果显示,path:mmu00260(甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸代谢)、path:mmu00330(精氨酸代谢)、path:mmu00380(色氨酸代谢)、path:mmu00350(酪氨酸代谢)及path:mmu00250(天冬氨酸代谢)等5条代谢通路呈现明显的DEGs富集;并且path:mmu00260和path:mmu00330中DEGs(Nos1、Nos2、Srm、Odc1、Smox、Aoc3、Shmt2、Gatm、Gamt和Phgdh)的qRT-PCR结果差异性均与转录组测序结果一致。以上结果提示,氨基酸代谢可能参与了PmCQ2感染。4.2 PmCQ2感染引起小鼠肺组织中多种游离氨基酸变化为了探究PmCQ2感染过程中小鼠肺组织游离氨基酸变化,本研究检测了小鼠肺组织中的游离氨基酸浓度。结果显示,在PmCQ2感染后,小鼠肺组织中一共有10种呈显著性下调,主要包括path:mmu00260中的甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser),path:mmu00330中的Arg,path:mmu00350中的酪氨酸(Tyr)等。以上结果与转录组测序结果可相互佐证,进一步提示着氨基酸在多杀性巴氏杆菌感染过程中可能发挥着重要的作用。4.3 Gly、Thr、Ser均不直接影响PmCQ2在体外培养中的生长繁殖为了探究氨基酸是否直接作用于体外培养的多杀性巴氏杆菌,本研究利用不同浓度的Gly、Thr、Ser(path:mmu00260)添加到体外马丁肉汤培养基和LB培养基培养的PmCQ2中,测定PmCQ2生长曲线。结果显示,不同浓度的Gly、Thr、Ser均不影响不同培养基培养的PmCQ2生长。该结果提示着,Gly、Thr、Ser均不直接作用于体外培养的PmCQ2。4.4在体外添加Gly、Thr、Ser可降低PmCQ2引起的巨噬细胞炎性反应为了进一步探究添加外源Gly、Thr、Ser对PmCQ2引起的巨噬细胞炎性反应的影响,本研究利用LDH检测添加不同浓度(0mM、1mM、5mM、10mM)Gly、Thr、Ser对细胞的毒性作用;选择最佳浓度的氨基酸处理细胞2h后,感染PmCQ2 16h,检测细胞内和培养上清中的细菌含量及炎性因子IL1β、IL17、TNFα和IFNγ的分泌情况。结果显示,不同浓度的Gly、Thr、Ser均没有造成细胞毒性,且本试验最佳浓度为10mM;Gly、Thr、Ser均不显著性影响细胞内和培养上清中的细菌量;但添加Gly、Ser后,上清中炎性因子IL1β、IL17、TNFα和IFNγ均呈显著性下调,添加Thr后,TNFα和IL1β显著性下调,IL17和IFNγ的分泌没有显著性差异。以上结果提示,Gly、Thr、Ser并不影响细胞的吞噬能力,但可降低多杀性巴氏杆菌引起的巨噬细胞炎性反应水平,并且添加Gly、Ser的作用强于添加外源Thr。4.5经滴鼻添加Ser可降低PmCQ2引起的小鼠肺组织炎性反应为了进一步探究添加外源氨基酸对PmCQ2引起的动物体内炎性反应的影响,本研究分别以滴鼻和肌肉注射Ser(0.1g/kg体重)的方式连续处理小鼠7d,腹腔感染PmCQ2,观察死亡情况;利用qRT-PCR和ELISA检测炎性因子IL1β、IL17、TNFα和IFNγ的表达和分泌情况。结果显示,两种途径添加Ser后并没有显著性影响小鼠的存活率;肌肉注射Ser不影响肺组织炎性因子的产生,但滴鼻添加Ser后则显著性下调了肺组织中炎性因子的表达和分泌。以上结果提示,滴鼻添加Ser后可降低多杀性巴氏杆菌引起的小鼠肺组织炎性反应水平。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61
【图文】：

受体,相互作用,干扰素,信号转导

1.1 IL12的结构及其与受体的相互作用[he structure and interaction of IL12 and theTAT1 信号转导早发现的细胞因子，因其能干扰病分为Ι型干扰素和ΙΙ型干扰素，前者是 IFNγ。天然 IFNγ 是由两个 17kDa 的多肽赖于细胞表面的 IFNγ 受体。IFNγ IFNγ 受体 2(IFNGR2)。前者主要功能。由于具有活性的 IFNγ 是非以 2:2 结合的[53-56]。当 IFNγ 与 IF构象发生改变，从而暴露 IFNG以此招募 JAK2，导致 JAK2 激酶发的 JAK1[57-59]。而 JAK1 磷酸化后会

受体,相互作用,增能,自分泌

自分泌途径来源的 TGFβ[87]。TGFβ Thl 的产生。此外，有研究表明 TN7 细胞的分化[88]。Th17 细胞经早期STAT3 又可直接结合分泌型 IL21 TAT3-Th17-IL21 的 IL21 自分泌环 RORγt 的活化以及 IL17 产生，这个活与维持（稳定阶段）则需要另一12 相同的 IL12p40 亚基，以及特有缺失时，体内的 Th17 细胞数量则显 TGFβ/ IL21 均可诱导 Th17 细胞表合后则可将信号进一步传递到 Thl7子如 TNFα、IL1β、IL6 从而极大的增能力，明显增加 IL17 水平[85]。值因子 IFNγ 和 IL4 均可抑制 Th17 细

【相似文献】