菌丝霉素源抗菌肽对金黄色葡萄球菌乳腺炎的防治及其耐药产生机制的研究

发布时间：2020-07-04 16:54

【摘要】：奶牛乳腺炎是困扰奶牛健康养殖的重要疾病。金黄色葡萄球菌(金葡菌)是引起奶牛乳腺炎最主要的病原菌之一。目前对奶牛乳腺炎常用的治疗方法是抗生素疗法。由于抗生素在治疗奶牛乳腺炎中具有多种缺点,如治愈率低,易残留等。奶牛养殖业急切需求抗生素替代品的应用。抗菌肽因其杀菌谱广、无残留和多靶点杀菌等优点,被认为是未来抗生素替代品最有力的候选者之一。然而,目前有研究发现细菌也可以产生抗菌肽耐药性。但是细菌获得可遗传抗菌肽耐药性的机制还不清楚。抗菌肽耐药性问题已成为阻碍抗菌肽大规模应用的重要因素。因此,进行抗菌肽耐药性产生机制的基础性研究已迫在眉睫。本研究首先评价了抗菌肽治疗金葡菌乳腺炎的效果,然后体外研究了金葡菌产生抗菌肽耐药性的机制,以期为抗菌肽在畜牧业的合理使用及降低细菌抗菌肽耐药的产生提供科学依据。本研究主要取得以下结果:1.抗菌肽对牛奶源金葡菌体外杀菌特性的研究。以牛奶来源的金葡菌为试验菌株,研究菌丝霉素源的抗菌肽(NZ2114和MP1102)在培养基、牛奶和奶牛乳腺上皮细胞内的杀菌效果,并选用常规抗生素四环素作为对照。结果表明8株牛奶来源的金葡菌对两种抗菌肽均敏感;两种抗菌肽在牛奶和奶牛乳腺上皮细胞中具有对金葡菌E48的高效杀菌能力,且效果优于四环素处理组。整体结果表明抗菌肽NZ2114和MP1102具有治疗奶牛金葡菌乳腺炎的潜力。2.体内检测抗菌肽治疗金葡菌乳腺炎的效果。本研究首先通过牛奶源金葡菌诱导了小鼠乳腺炎模型,然后据此评估了抗菌肽(NZ2114和MP1102)在体内乳腺环境中的杀菌及抗炎效果。结果表明:经过抗菌肽或四环素治疗后乳腺组织中金葡菌的数量显著下降,且抗菌肽的效果要好于抗生素(四环素、NZ2114和MP1102分别下降了1.48、2.9和3.15 log_(10)单位的金葡菌数量);两种抗菌肽均能抑制组织中促炎因子IL-6和TNF-α的急剧升高,缓解由金葡菌引起的炎症反应。3.耐抗菌肽金葡菌的诱导及其耐药分子机制的研究。金葡菌经过抗菌肽35天的持续诱导后其耐药性大幅提升。然后在经过10天无抗培养基的连续传代,金葡菌仍具有抗菌肽耐药性,其中NZ2114对金葡菌BA01611和Mu50的最小抑菌浓度分别上升到原来的32倍和16倍,Nisin对金葡菌BA01611和Mu50的最小抑菌浓度分别高于原来的4倍和2倍。此结果表明,抗菌肽的持续诱导会导致金葡菌获得可遗传的抗菌肽耐药性。通过对耐药菌的全基因组测序和功能分析,发现耐药菌株中多个基因发生突变。其中ndh基因在多株耐药菌中都发生了突变,其编码细菌膜结合呼吸酶,参与电子链的传递与活性氧簇(ROS)的产生。通过对其中一株耐药菌BA01611~(nzR)中所有突变基因进行回补,结果发现回补菌的抗菌肽耐药性均发生不同程度下降。此结果说明,耐药菌株中的基因突变对其抗菌肽耐药性的变化具有重要作用。4.ROS在金黄色葡萄球菌抗菌肽耐药性产生中的作用研究。我们通过荧光探针标记的方法测定了抗菌肽处理金葡菌后其胞内ROS含量的变化,并进一步测定了细菌的利福平突变率变化。结果表明抗菌肽处理后,金葡菌中ROS的含量明显上升,ROS引起了细菌利福平突变率增加,在一定浓度范围内,两者之间存在显著的线性关系(R~2=0.7702)。无氧和缺乏铁离子的环境中抗菌肽的刺激不会引起细菌利福平突变率的升高,且铁离子稳态失衡菌株BA01611Δfur在无抗菌肽刺激时其利福平突变率显著高于抗菌肽处理的野生株。这些结果说明,ROS在金葡菌抗菌肽耐药性产生中具有关键作用。综上所述,本研究首先表明抗菌肽有应用到治疗奶牛金葡菌乳腺炎中的潜力。其次,在探究金葡菌抗菌肽耐药的产生机制时,鉴定出多个新的与抗菌肽耐药性相关的突变基因;证明了ROS在金葡菌抗菌肽耐药性进化中具有重要作用。此外,研究结果还提示在未来使用抗菌肽时可以联合铁离子螯合剂共同使用,以降低细菌的突变率进而阻碍抗菌肽耐药性的产生。最终,本研究以期为抗菌肽在畜牧业的合理使用及降低细菌抗菌肽耐药性的产生提供科学依据。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.23
【图文】：

粘附素,金黄色葡萄球菌,金葡菌

途径会引发金葡菌感染：一，当皮肤、粘膜表层出现破损时或手术切口、导管插入口时，此时金葡菌很容易进入到皮下组织中，导致感染的发生；二，当机体免疫力较弱时，金葡菌可以通过呼吸系统进入组织内继而引发感染，如肺炎等。金葡菌感染后，一般其能存活于细胞外的血液、淋巴液和组织液中，甚至能够存活在巨噬细胞、中性粒细胞、上皮细胞和内皮细胞中。如在奶牛的金葡菌乳腺炎中，金葡菌能侵入到奶牛的乳腺上皮细胞中(Bayles et al. 1998)。金葡菌侵染宿主细胞的机制十分复杂，包括：粘附于宿主细胞胞外基质；躲避吞噬细胞的杀菌和溶菌作用，逃避宿主的免疫应答；产生和释放毒素或其他活性物质，最后引发宿主细胞的损害或死亡(Fraunholz and Sinha 2012)。金葡菌能够粘附在细胞外基质和血浆蛋白上，是金葡菌侵染宿主细胞的第一步。当金葡菌与宿主细胞相接触时,其通过其表面的黏附素与宿主的细胞外基质结合，促使细菌粘附到细胞上(Foster et al. 2014)。介导此过程的细菌粘附素主要包括以下几种（图 1-1）：一，与细胞壁锚定在一起的粘附素，如识别粘附基质分子的微生物表面组分（MSCRAMMs）；二，可以跨膜的粘附素，如弹性蛋白结合蛋白（Ebp）；三，非蛋白质性（脂性）核糖磷壁酸, 如细胞壁磷壁酸（WTAs）；四，未于细胞壁结合（分泌或可溶性）的粘附素，如金葡菌胞外粘附蛋白等。

正常状态,菌体,单电子还原,有氧代谢

参与杀菌还存在较大争议(Keren et al. 2013)，但关于致的。与清除有氧代谢过程中通过连续的单电子还原在细胞内产氢（H2O2）和具有高度破坏性的羟基自由基（ OH）等会很容易的扩散到微生物细胞中，并和许多细胞中的生要的是 O2和黄素酶的相互作用，黄素酶其活性位点内很容易参与到与 O2相关的电子传递。O2 和 H2O2 都也有研究表明呼吸链主要产生的是 O2 而不是 H在细胞稳态下产生可观量的 H2O2的具体机制尚不清楚反应(H2O2+ Fe2+→ OH +OH-+ Fe3+)产生的，此反应与-韦斯反应中三价铁（Fe3+）被 O2 还原为 Fe2+。O2 不，还有可能还原性地攻击携带铁-硫簇的酶，从而使其and Beinert 2003)。

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