耐药性结核分枝杆菌对四种细胞因子的影响及抑制NF-κB通路的初步研究

发布时间：2020-07-06 07:08

【摘要】：结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的慢性消耗性、人畜共患的传染性疾病。每年全球约有1千万病例感染结核杆菌,约有300万人死于结核病。如今结核病的出现不仅对人类健康造成了巨大的威胁,也严重影响了养殖业的发展,特别是耐药结核分枝杆菌的出现。抗结核化学药物用于临床治疗结核病已有数十年,而用药不合理、艾滋病的流行等原因,导致了耐药结核菌的产生使结核病的治疗更加困难。因此,本研究通过使用异烟肼(Isonicotinic acid hydrazide,INH)药物对标准菌株H37Rv进行不同梯度的诱导,对耐药菌株与巨噬细胞作用后对感染相关主要细胞因子的影响及免疫逃逸的初步研究。对标准菌株H37Rv和本实验室分离的野毒株进行异烟肼药物最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)值测定。以标准菌株H37Rv的MIC值作为标准,分别用1/8MIC、1/2MIC、1/4MIC、MIC、2MIC和4MIC对H37Rv进行诱导,对诱导后菌株进行MIC值测定,测定结果与标准菌株H37Rv的MIC进行比较,诱导后菌株的MIC值与H37Rv相比变大,且诱导菌株用药浓度越大则MIC越大。将标准菌株H37Rv,野毒株与不同梯度诱导的菌株感染RAW264.7巨噬细胞,应用CCK-8法检测感染后的细胞增殖状况,应用ELISA方法和荧光定量PCR检测细胞因子IL-6、IL-10、IL-1β和TNF-α的表达量和转录水平。结果表明细胞增殖在前8h增加,在8h时达到最大,8h后细胞增殖量下降,不同毒力菌株感染细胞后细胞因子的分泌量和转录水平都呈现上升趋势,且MIC、2MIC和4MIC诱导菌株的表达量和转录水平高于其他诱导菌株。结核分枝杆菌感染RAW264.7细胞后能够引起MAPK等通路的激活或抑制,本文通过western blot对MAPK通路中的p38、JNK和ERK以及磷酸化蛋白含量进行检测,结果发现标准菌株H37Rv的蛋白表达量高于诱导菌株和野毒株,且低浓度药物诱导菌株的蛋白表达量高于高浓度药物诱导菌株。通过用NF-κB活化抑制剂对巨噬细胞进行处理后,应用Griess法检测巨噬细胞在不同时间点NO的分泌情况和NF-κB蛋白含量的变化,结果发现,NO分泌量和NF-κB蛋白含量整体上升,然后随时间的增加后降低,无抑制剂时在8h和4h时表达量最高,加入抑制剂后表达量最高的时间点有所推迟。诱导菌株的NO分泌量和NF-κB蛋白含量低于H37Rv菌株,诱导梯度越高表达量越低,野毒株和4MIC诱导菌株的表达量相近。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61
【图文】：

1.3 结果1.3.1 抗酸染色结果将采集的菌株进行抗酸染色结果见图1.1。图1.1抗酸染色结果Fig.1.1 The results of acid resistant dying1.3.2 荧光定量PCR结果提取采集的 237 组织样品基因组，利用通用型引物 16S 及探针对提取的基因组进行荧光定量 PCR 检测，见图 1.2，共检出结核菌阳性 41 份，总阳性率为 17.3 %。不同地点（长春 12 份、松原 8 份、吉林 11 份和通化 10 份）、不同性别（公鹿 24 份和母鹿 17 份）及不同年龄（仔鹿 8 份、育成鹿 16 份和成年鹿 17 份）的梅花鹿均存在结核分枝杆菌感染情况。结果见表 1-6 所示：

图 1.2 16S 通用引物荧光定量 PCR 检测结果Fig.1.2 Results of Fluorescence quantitative PCR by 16Sprimr表 1-6 荧光定量 PCR 检测结果Tab.1-6 The results of Fluorescence quantitative PCR因素 检测样本 阳性样本 阳性率（%）地点长春 67 12 17.91松原 51 8 15.69吉林 62 11 17.74通化 57 10 17.54性别公鹿 128 24 18.75母鹿 109 17 15.6年龄仔鹿 59 8 13.56育成鹿 92 16 17.39成年鹿 86 17 19.77

合计 237 41 17.31.3.3 菌株诱导生长和MIC值测定结果结核分枝杆菌在罗氏培养基上生长形状为菜花样，见图1.3，在7H9液体培养基中生长为米白色颗粒并且有菌膜生成，见图1.4，标准菌株H37Rv和野毒株进行药物异烟肼MIC测定，分别为0.196mg/mL和1.562mg/mL见图1.5和1.6。则进行诱导的1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC和4MIC的浓度分别为0.025、0.049、0.098、0.196、0.392和0.784mg/mL。将MIC诱导菌株和4MIC诱导菌株进行MIC测定，它们MIC值分别为3.125mg/mL和12.5mg/mL，见图1.7和1.8。

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