禽腺病毒血清4型新型检测方法的建立

发布时间：2020-07-05 20:15

【摘要】：2015年7月起,由禽腺病毒血清4型(FAd V-4)中国流行株引起的以剖检病变主要为心包膜内有浅黄色的积液、肝脏黄染、肿大和出血为特征的鸡肝炎-心包积液综合征(HHS)在我国山东、河南、安徽和江苏等省份大面积流行。该病主要危害3-5周龄肉鸡,表现为突发性死亡,死亡率20%-60%,最高可达80%,为我国养禽业带来很大的经济损失。本课题组与国内其他研究表明,引起此次HHS流行的FAd V-4中国流行株属于新的基因型,与早期报道的致病性和非致病性的FAd V-4相比,FAd V-4中国流行株的基因组和主要结构基因有较明显的差异,氨基酸的突变和缺失主要集中在fiber2蛋白。为了客观准确地监测FAd V-4中国流行株在鸡群中的流行状况,本研究从血清学及分子生物学方面建立了新型的FAd V-4检测方法,对鸡群进行监测,以期为HHS疫情的监测防控提供方法。1.禽腺病毒血清4型RPA-LFD快速检测方法的建立为了建立一种快速、灵敏、简便的FAd V-4现场检测方法,本研究将重组酶聚合酶扩增(RPA)与胶体金侧向流试纸条(LFD)技术联合,设计针对FAd V-4 hexon基因的特异性RPA引物,上、下游引物的5’端分别进行6-羧基荧光素(FAM)和生物素(Biotin)标记。通过对引物浓度、RPA反应时间和温度等条件的优化,建立了一种可用于FAd V-4现场检测的RPA-LFD方法。该检测方法在25-45℃恒温反应15 min即可实现对FAd V-4目的基因片段的有效扩增,RPA扩增产物用胶体金侧向流试纸条进行检测,检测结果肉眼可见。该方法的最低检测限为100拷贝,敏感性是常规PCR的100倍,且与其他常见禽病病原核酸检测无交叉反应。结果显示,本研究建立的RPA-LFD可用于FAd V-4的临床快速检测,为FAd V-4感染的流行病学检测提供了一种有效方法。2.基于FAd V-4中国流行株fiber2蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立为了建立用于禽腺病毒血清4型中国流行株的血清流行病学监测方法,本研究利用在大肠杆菌中表达的FAd V-4中国流行株fiber2 C-末端蛋白作为包被抗原,建立了检测抗FAd V-4中国流行株抗体的间接ELISA方法。所建立方法的优化后的最佳条件为:抗原最适包被量为0.25μg/孔,包被时间为37℃1 h,然后4℃过夜;被检血清的最佳稀释度为1:800,作用时间为2 h;二抗选用HRP标记的兔抗鸡Ig Y,稀释度为1:4 000,作用时间为1.5 h;显色液TMB作用条件为室温5 min。所建立ELISA的判定标准为:样品的S/P值大于或等于0.0553判为阳性,小于0.0418判为阴性。用建立的ELISA方法对抗鸡新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法有较好的特异性,组内和组间重复的最大变异系数为5.6%和5.7%,所建立的ELISA方法重复性良好。用所建立的ELISA方法对50份来自于疑似患肝炎-心包积液合征病鸡的血清样品进行检测,阳性检出率为98%,与FAd V-4病原学检测结果符合率为100%。结果表明,本研究所建立的ELISA方法可用于抗FAd V-4中国流行株抗体的检测,为肝炎-心包积液综合征病监测和流行病学调查提供了方法。3.抗Hexon469-775aa蛋白单克隆抗体的制备及鉴定本研究以纯化的FAd V-4全病毒为免疫原免疫小鼠制备单克隆抗体,用I群禽腺病毒hexon保守区(469-775aa)重组蛋白筛选出4株单克隆抗体。4株单克隆抗体亚类均为Ig G2b,且能够特异性识别FAd V-4、FAd V-8b、FAd V-11的hexon蛋白,与新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法师囊病毒、禽流感病毒均不发生特异性反应。结果表明,hexon蛋白469-775aa区域携带有禽腺病毒群特异性抗原,重组hexon469-775aa蛋白和筛选得到的单克隆抗体能够用来建立多种临床相关的禽腺病毒的检测方法,并为评价禽腺病毒免疫或感染后产生的抗体水平打下基础。4.禽腺病毒双抗体夹心ELISA检测抗原的方法建立本研究以抗hexon469-775aa单克隆抗体为捕获抗体,对各反应条件进行了优化,建立了检测禽腺病毒的双抗体夹心ELISA方法。所建立的ELISA方法特异性良好,与传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、减蛋综合征病毒均无交叉反应。批间和批内的重复试验变异系数均小于10%,表明建立的ELISA方法稳定性良好。用所建立的双抗体夹心ELISA方法对50份临床样品进行检测,检测结果与禽腺病毒PCR病原检测结果相符。结果表明,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法可用于临床禽腺病毒感染情况的监测,为我国禽腺病毒感染的流行病学调查奠定了基础。
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

示意图,禽腺病毒,粒子结构,示意图

室温存活时间较长，60 ℃加热 30 min 或者剂如乙醚、氯仿、2%的酚与 5%的乙酸等抵抗力均可被浓度为 0.1%的甲醛灭活，高温如 60 ℃加热 1使禽腺病毒灭活，也可被 DNA 抑制剂 5-碘脱氧蛋白及功能组的两条 DNA 单链上，共有 46 个潜在的蛋白质s）（正义链上的 ORFs 占 57%）。FAdV-4 基因组的，28 个代表属特异性基因[18]。FAdVs 编码区的编邻体蛋白（hexon）、纤突蛋白（fiber）、pVI、pVfiber 蛋白为 FAdVs 的主要结构蛋白。 5 个多肽相互作用而成，其与 fiber 蛋白以共价键正二十面体病毒衣壳的顶端。Fiber 蛋白可分为尾连；杆部一般由 22 个重复的亚单位构成，每个亚图 1 禽腺病毒粒子结构示意图Fig1 The vision of FAdV

禽腺病毒,血清,心包膜

2 禽腺病毒血清 4 型的流行病学研究1987 年，巴基斯坦首次暴发了由 FAdV-4 引起的疾病，其特征是心包膜内积累有淡黄色的液体，肾炎，肝炎。因发病地点靠近巴基斯坦的安加拉地区，故被称为“安加拉病”。1994年在印度第一次暴发了 FAdV-4 引起的 HHS，之后短短的几个月，该病就传播到印度的其他地区。因该病剖检可见心包膜大量积液，导致眼观病变心脏与荔枝形态相似，又被称为“荔枝病”。随后，疫情已扩大到其他国家，包括伊拉克，印度，日本，墨西哥，智利，厄瓜多尔，秘鲁，俄罗斯，斯洛伐克，孟加拉国，韩国和中国（图 2）。

剖检,组织学检查,肝脏,心脏

3 禽腺病毒的检测方法3.1 病原的分离鉴定FAdV-4 在感染鸡只的肝脏上的含量较高。可以在无菌条件下，取感染或病死鸡只的肝脏组织进行研磨，制成组织悬液，冻融后离心取上清，经绒毛尿囊膜或卵黄囊途径[27]接种SPF 鸡胚。鸡胚出现死胚、胚胎充血、发育迟缓，剖检可见肝脏肿大出血，脾脏肿大，镜检可看到肝细胞内有嗜碱性或嗜酸性核内包涵体[28]。除了通过鸡胚接种传代的方法进行病毒的分离鉴定外，也可以用细胞培养的方法进行病毒的分离鉴定。FAdVs 可在鸡胚原代肾细胞（CEK）、鸡胚原代肝细胞（CEL）[26, 29]、鸡肝癌细胞（LMH）上进行增殖。病毒感染的细胞出现明显的细胞形态变化，如细胞变圆，折光性变强，最后脱落。李海英[30]、何秀苗[31]利用 CEK 对分离到的 FAdVI-JS 株进行病毒[32][33]图 3. 剖检、组织学检查感染 HHS 鸡只的心脏、肝脏[26]Fig 3. Postmortem and histological examinations of the liver and heart from affected birds with HHS.A. The accumulation of clear, straw-colored fluid in the pericardial sac and a discolored swollen liver withpinpoint hemorrhage; B. Small multifocal areas of necrosis and basophilic intranuclear inclusion bodies inhepatocytes (H&E stain, original magnification×400, scale bar=50 μm); C. Lymphocytic infiltrates in associationwith myocarditis (H&E stain, original magnification×400, scale bar=50 μm).

【参考文献】