单克隆抗体夹心ELISA检测猪圆环病毒2型抗原含量的研究

发布时间：2020-07-05 19:34

【摘要】：猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是1974年发现的一种无囊膜单股环状DNA病毒,分3个型。猪圆环病毒1型(PCV1)对猪无致病性,猪圆环病毒2型(PCV2)则可引起猪断奶后多系统衰弱综合征(PMWS)、皮炎和肾病综合征(PDNS)、仔猪先天性震颤(CT)、坏死性增生性肺炎(PNP)、猪呼吸道综合征(PRDC)、母猪繁殖障碍等多种猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus-associated desease,PCVAD)。猪圆环病毒3型(PCV3)是近几年新发现的,其致病性及致病机理仍有待研究。因此,防控PCV2的感染成为了养猪业的重中之重,其中疫苗免疫是最有效的防控手段之一,疫苗质量的优劣便成为能否有效防控的关键。但PCV2商品化疫苗品种众多,不同类型或不同生产企业生产的疫苗效力检验方法差异较大,很难形成统一的评价标准。影响疫苗质量的因素较多,但对于灭活疫苗或亚单位疫苗而言,抗原含量的多少则成为疫苗优劣的最重要指标之一,PCV2的衣壳由60个ORF2编码的衣壳蛋白组成,这也是PCV2的唯一结构蛋白,具有较好的免疫原性和抗原性,因此针对Cap蛋白的绝对定量方法无疑是一种更具吸引力的方法,这种方法对于评价疫苗质量甚至替代免疫攻毒等效力检验方法也是非常必要的。本研究以大肠杆菌表达PCV2 Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,经检测抗体水平取脾脏制备淋巴细胞,经细胞融合、亚克隆以及间接ELISA筛选,获得2株杂交瘤细胞株,命名为7D7和5C2。经间接夹心ELISA检测,均与PCV2全病毒和PCV2 Cap蛋白反应,且针对不同的抗原表位,其中7D7的反应性更好。经SDS-PAGE,Western Blot检测结果显示7D7和5C2不仅能特异性识别大肠杆菌表达PCV2 Cap蛋白(约26 kDa),也能特异性的与杆状病毒表达PCV2 Cap蛋白(约30 kDa)反应,且为线性表位。单克隆抗体亚型间接ELISA结果显示两株单抗均为IgG2a亚型。鉴于7D7的反应性较好,因此,用改良的过碘酸钠法对单抗7D7进行辣根过氧化物酶标记,形成酶标单抗7D7-HRP。以单克隆抗体7D7作为捕获抗体,7D7-HRP为检测抗体,成功建立了检测PCV2抗原的单克隆抗体夹心ELISA方法,该方法以杆状病毒表达的Cap蛋白为标准抗原,线性范围是0.1096 ng/mL-14.2222 ng/mL,相关系数0.99,变异系数10%,回收率在90%以上,且与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)等多种病毒抗原无交叉反应。对13个厂家的猪圆环病毒疫苗进行了检测,显示不同企业疫苗抗原含量差异明显,13家疫苗中有7家疫苗的抗原含量超过了本方法的上限值,6家疫苗的检测值处于标准曲线线性范围内,其中1家疫苗的抗原含量较低,与抗原含量高者相差至少20倍。综上所述,本研究成功筛选了2株针对不同线性表位的PCV2单克隆抗体,为进一步研究PCV2抗原表位分布及特性提供了实验材料。建立了背景值低,特异性好,灵敏性强,准确度高的用于PCV2抗原含量测定的单克隆抗体夹心ELISA方法,为PCV2疫苗生产工艺研究和质量控制以及传统疫苗效检方法替代方法的研究奠定了基础,也为目前解决PCV2疫苗品种多、生产企业多、质量标准不统一,监管难度大提供了技术支撑。
【学位授予单位】：中国兽医药品监察所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.4
【图文】：

的 PCV2 Cap 蛋白；2：原 2-1 抗原的 SDS-PAGE 鉴测定2 Cap 蛋白，用间接 ELIS清中抗体效价大于 12800 2-1 小鼠 ELISA 抗体效价OD450待检血清 小鼠阴性血1.5011 0.0681 1.3641 0.0587 1.1769 0.0606 1.0580 0.0490 0.8670 0.0491 0.6320 0.0523 0.3570 0.0508

国兽医药品监察所硕士学位论文 第二章 单克隆抗体的制备与特性研.4.3 杂交瘤细胞株的建立取脾细胞与骨髓瘤细胞 SP2/0 按常规方法融合后，用间接 ELISA 方法筛选阳性杂交瘤细胞限稀释法进行 3 次亚克隆后最终获得 2 株可稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为 7D 5C2（表 2-2 和图 2-2）。表 2-2 杂交瘤细胞的筛选7D7 5C2 阴性血清第 1 次 0.5732 0.4686 0.0523第 2 次 1.1313 1.0704 0.0587第 3 次 1.2255 1.1864 0.0490

M：Marker 1：BSA（66 KDa） 2：7D7 3：5C图 2-3 两株单克隆抗体的 SDS-PAGE 鉴定的鉴定亚型鉴定显示，单克隆抗体 7D7 和 5C2 均为 IgG2a 亚型。

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本文编号：2743033