LN-PCV3分子特性及其与PCV2的二联重组杆状病毒疫苗的构建和免疫原性分析

发布时间：2020-07-05 17:48

【摘要】：目的对猪圆环病毒3型辽宁分离株(LN-PCV3)的分子特征进行分析,并依据广泛流行的猪圆环病毒2型(PCV2)给养猪业带来的重大经济损失,特别是二者混合感染,带来更大经济损失的现状,本研究利用杆状病毒表达系统分别构建了表达PCV3 Cap基因的单联疫苗和融合表达PCV2和PCV3 Cap蛋白基因的二联疫苗,并对其免疫原性进行评估,为PCV2和PCV3的综合防治储备了物质基础。方法参照湖北分离株HB-PCV3-2016(GenBank登录号:KY954038.1)设计特异性引物,以PCR检测PCV3阳性的样品为模板,对全基因进行PCR扩增,将PCR产物使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后,与pMD-18-T载体进行连接,转化到DH5a感受态细胞中,筛选得到的阳性克隆菌落进行质粒提取,进行酶切鉴定,酶切鉴定正确的质粒送生工生物公司进行测序。将测序得到的基因序列用Mega7.0和DNAStar软件进行分析,与GenBank公布的PCV3其他分离株基因序列进行比对和分子特性分析。在此基础上,分别选取PCV2疫苗株PCV2-SH(登陆号:HM038027.1)的Cap蛋白基因和LN-PCV3的Cap蛋白基因,用刚性连接肽Linker将PCV2 Cap蛋白基因与PCV3 Cap蛋白基因进行连接融合,作为免疫原基因。根据昆虫细胞密码子偏爱性、对免疫原基因进行人工修饰、优化和合成,获得免疫原基因PCV2-3-Cap,并克隆至pMD-18-T载体,构建重组质粒T-PCV2-3-Cap。分别以优化后的PCV3-Cap蛋白基因和PCV2-3-Cap融合蛋白基因为靶基因,设计特异性引物,以T-PCV2-3-Cap为模板,扩增PCV3-Cap和PCV2-3-Cap蛋白基因,转化到DH5a感受态细胞中,筛选得到的阳性克隆菌落进行质粒提取,进行酶切鉴定。将鉴定正确的PCV3-Cap基因和PCV2-3-Cap融合基因克隆至pFastBac 1载体上,分别构建杆状病毒转移载体pFastBac-PCV3-Cap和pFastBac-PCV2-3-Cap。将pFastBac-PCV3-Cap和pFastBac-PCV2-3-Cap分别转化到DH10Bac感受态细胞中进行转座,经过蓝白斑筛选后,提取重组杆粒,并转染SF9昆虫细胞,通过筛选获得表达PCV3 Cap基因与共表达PCV2和PCV3 Cap融合基因的重组杆状病毒,经PCR,SDS-PAGE,Western blot,免疫荧光,电镜等实验方法鉴定正确后,用蔗糖密度离心法对病毒进行纯化。所得的纯化病毒作为免疫原,以1x10~8pfu的重组杆状病毒rvAc-PCV3-Cap与rvAc-PCV2-3-Cap免疫BALB/c小鼠,并设免疫对照组,每隔2周进行一次免疫,连续免疫三次,分别在首免后0d,14d,28d,42d对小鼠尾部进行采血并分离血清。用ELISA方法检测PCV2和PCV3的抗体水平。首免后42d,处死小鼠摘取脾脏,通过CCK-8法计算各免疫组之间小鼠的淋巴细胞增值指数SI。按照细胞因子检测试剂盒的使用方法,对免疫小鼠的IL-2,IL-4,IFN-γ等细胞因子进行检测,从而验证PCV3-Cap蛋白基因、PCV2-3-Cap融合蛋白基因在杆状病毒系统中的表达效果及其免疫原性。结果通过PCR方法从PCV3阳性样品中,克隆到PCV3全基因序列,长度为2000bp,命名为LN-PCV3(GenBank登录号:MH177453.1)。遗传进化树分析显示,我国目前流行的PCV3分离株可形成3个分支(3a簇、3b簇与3c簇),LN-PCV3株处于3a簇分支中,与湖北株HB-PCV3-2016(GenBank登录号:KY354039.1)同源性最高,达到99.7%。在此基础上,将构建的重组杆状病毒转移载体pFastBac-PCV3-Cap和pFastBac-PCV2-3-Cap,分别转化到DH10Bac感受态细胞中进行转座后,PCR交叉检验证明获得重组杆粒rAcBacmid-PCV3-Cap和rAcBacmid-PCV2-3-Cap。然后将重组杆粒转染SF9昆虫细胞,制备重组杆状病毒,重组杆状病毒连续传代3次,传代3次(P3代)重组杆状病毒rvAc-PCV3-Cap与rvAc-PCV2-3-Cap经透射电镜观察,可见假病毒粒子和杆状病毒粒子。用M13通用引物、PCV3-Cap基因特异引物、PCV2-3-Cap基因特异性引物分别进行PCR扩增,可见674bp与2974bp,1514bp与3814bp处出现目的片段,大小均与理论值一致。分别通过SDS-PAGE和Western blot检测,在30kD与55kD处出现目的条带。通过免疫荧光实验,两组重组蛋白在荧光显微镜下均出现绿色荧光,正常细胞未出现荧光效果,证明PCV3-Cap基因、PCV2-3-Cap融合基因在SF9细胞中获得表达,并且成功筛选到重组杆状病毒rvAc-PCV3-Cap与rvAc-PCV2-3-Cap。抗体水平检测结果表明,rvAc-PCV3-Cap和rvAc-PCV2-3-Cap免疫组PCV3抗体水平均明显高于PBS阴性对照组与PCV2灭活苗阳性对照组,差异显著(P0.05),但rvAc-PCV3-CAP和rvAc-PCV2-3-Cap免疫组间PCV3抗体水平差异不显著(P0.05)。rvAc-PCV2-3-Cap免疫组PCV2抗体水平均明显高于PBS阴性对照组和rvAc-PCV3-Cap组,差异显著(P0.05),但与PCV2灭活苗阳性对照组相比,抗体水平差异不显著(P0.05)。CCK-8法检测小鼠脾淋巴细胞增值指数(SI)的结果显示,rvAc-PCV3-Cap与rvAc-PCV2-3-Cap免疫组、PCV2灭活苗阳性对照组均与PBS组相比,SI值差异显著(P0.05),但其他三个免疫组间相比,差异并不显著(P0.05)。细胞因子水平检测表明,证明注射重组杆状病毒组能够刺激机体提高IL-2,IL-4,IFN-γ的分泌水平,与PCV2灭活苗组差异不显著(P0.05),但明显高于PBS阴性对照组(P0.05)。结论1.成功对LN-PCV3进行了全基因克隆,并对其分子生物学特性进行了分析。2.利用杆状病毒表达系统实现了PCV3 Cap蛋白基因和PCV2、PCV3 Cap蛋白融合基因的表达,并成功筛选到了重组杆状病毒rvAc-PCV3-Cap与rvAc-PCV2-3-Cap。3.小鼠免疫实验表明重组杆状病毒rvAc-PCV3-Cap与rvAc-PCV2-3-Cap能够刺激机体产生特异性体液免疫和细胞免疫应答,为猪圆环病毒新型疫苗研制提供了技术支持和物质储备。
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.4
【图文】：

标准曲线,分子特性,病料,避光

L/well 加入 TMB，37℃避光孵育 30min。100μL/well 加入迅速加入 Stop solution 终止长 450nm 读值。定制标准曲线，计算 IL-4 的浓度。结果毒 3 型全基因克隆及分子特性研究N 株全基因克隆结果V3 的阳性病料用已经设计好的全基因引物进与理论值相符。(图 1) 。

酶切鉴定,质粒,同源性,分子特性

图 2 T-PCV3 阳性质粒酶切鉴定结果A Marker DL5000；1.PCV3 基因酶切 2.阴性对的分子特性研究源性分析结果显示 PCV3 可分为 3 大分支 LN-PCV3 与 USMO-PC-PCV3-2017,SH-PCV3-2016 同属与 3a 簇性最高，达到 99.7%，与其他 3a 簇同源性在株基因的同源性在 98.4%～99.7%之间同源性为 98.3%（如图 3，图 4 所示）。

【参考文献】