RanGAP1对牛肌肉卫星细胞分化的影响
发布时间：2020-07-06 15:34
【摘要】：肌肉卫星细胞是一种在肌肉发育过程中紧贴在骨骼肌细胞表面扁平有突起的肌源性干细胞,是发育生物学研究的重要内容,在发育过程中会融合成多核肌管,最后形成肌纤维。本研究以牛肌肉卫星细胞(Muscle-Derived Satellite Cells,MDSCs)为研究对象,通过体外培养、体外分化、蛋白免疫印迹、免疫荧光染色等实验技术,检测RanGTPase的激活蛋白RanGAP1(RanGTPase activating protein 1)在牛MDSCs体外分化过程中表达的变化,研究RanGAP1在过表达和低表达时,对MDSCs体外分化过程的影响,探究RanGAP1在MDSCs体外分化过程中与PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路的关系,来探讨RanGAP1对牛肌肉卫星细胞分化的影响。具体实验内容及结果如下:(1)RanGAP1表达水平研究:通过牛MDSCs体外分化,收集分化0 d、1 d、2 d、3 d的蛋白样,Western blot结果显示,随着体外分化时间的增加,RanGAP1的蛋白含量逐渐增加,MYOG的蛋白含量也逐渐增加。另外,通过免疫荧光染色分化0 d、1 d、3 d的体外分化的牛MDSCs,发现0 d没有肌管形成,1 d开始出现小型肌管,3 d小型肌管开始融合,形成多核肌管。(2)RanGAP1的过表达:通过CRISPR-dCas9技术构建激活载体vpr+R3。转染24h后,RanGAP1的蛋白含量增加,同时分化标记因子(myogenin,MYOG)的含量也同时增加。免疫荧光染色结果显示,vpr+R3组的肌管融合率明显增高。(3)抑制RanGAP1的表达:通过CRISPR-dCas9技术构建抑制载体dcas9+R3,转染24 h后,RanGAP1蛋白含量降低,同时MYOG的含量也降低。免疫荧光染色结果显示,dcas9+R3组的肌管融合率明显降低。(4)RanGAP1与PI3K/AKT信号通路的关系:牛MDSCs分化培养体系中加入PI3K抑制剂LY294002 24 h后检测,显示抑制剂组RanBP2、RanGAP1和MYOG的蛋白含量都下降。(5)RanGAP1与MAPK/ERK1/2信号通路的关系:牛MDSCs分化培养体系中加入MAPK/ERK抑制剂U0126 24 h后检测,显示抑制剂组RanBP2、RanGAP1和MYOG的含量都没有明显变化。结果表明:RanGAP1促进牛MDSCs分化,在分化过程中受PI3K/AKT信号通路的调控,而不受MAPK/ERK1/2信号通路的影响。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823
【图文】：
图 2-1 sgRNA Vector 质粒图谱[167]Fig. 2-1 sgRNA Vector map（2）酶切 sgRNA 表达载体按照以下酶切体系，用 Bbs I 酶去酶切 sgRNA 表达载体（见图 2-1），酶切后的产物进行凝胶电泳，切取所需载体条带的胶块，最后通过胶回收试剂盒回收含有粘性末端的 sgRNA表达载体。载体酶切见表 2-2。表 2-2 载体酶切体系Table 2-2 The reaction system of digestion of the vector成分 体积（μL）Bbs I 酶 110x 缓冲液 2sgRNA 载体 1加去离子水至 20（3）干扰片段引物退火按照以下退火体系，加入上下游引物，最后加入去离子水使终体积达到 50 μL，进行退火
蓝色是细胞核（200×）。is Desmin, blue is nucleus（200×）.图 3-1 牛结蛋白免疫荧光染色Fig. 3-1 Immunofluorescence assay of Desmin牛 MDSCs 分化 1 d 后经免疫荧光染色，Desmin 呈阳性。图中显示的in，蓝色为 DAPI 染色的细胞核。Desmin 是 MDSCs 分化结构肌管的主特异性标志。经免疫荧光染色后肌管呈绿色，表明分离的细胞为牛 MGAP1 在牛 MDSCs 分化不同时期中的表达nGAP1 蛋白表达化 0 d，1 d，2 d 和 3 d 的牛 MDSCs，用 Western Blot 实验检测各时期1 和 MYOG 蛋白量的变化情况。件 ImageJ对反应条带进行灰度扫描，计算 RanGAP1及 MYOG与内参基出 RanGAP1 及 MYOG 蛋白在四个时期段的相对表达量结果，见图 3
注：绿色是 RanGAP1，蓝色是细胞核（200×）。Note: Green is RanGAP1, blue is nucleus（200×）.图 3-3 免疫荧光实验检测分化不同时期 RanGAP1 表达量Fig. 3-3 Immunofluorescence assay of RanGAP1 during bovine MDSCs differentiation结果显示：牛 MDSCs 分化 0 d 的时候，没有出现肌管；分化 1 d 时，有少量小型肌管；分化 3 d 时，出现多核大肌管。且分化过程中肌管的亮度也逐渐增加。由此可见，随着牛 MDSCs的不断分化，细胞的融合度逐渐增加，肌管中 RanGAP1 蛋白量逐渐升高。蛋白水平和形态方面可以得出，在牛 MDSCs 分化过程中，RanGAP1 含量逐渐增加。由此可见，RanGAP1 与牛 MDSCs 分化有一定的联系。3.3 RanGAP1 对牛 MDSCs 分化的影响3.3.1 RanGAP1 过表达3.3.1.1 筛选 RanGAP1 过表达效率最高的载体通过 PEI 方法将 sgRNA，sgRNA-R1，sgRNA-R2，sgRNA-R3，sgRNA-R4 分别与 vpr 共同转染牛 MDSCs，转染 24 h 后，利用 Western Blot 实验检测牛 MDSCs 中 RanGAP1 的蛋白
本文编号：2743827
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823
【图文】：
图 2-1 sgRNA Vector 质粒图谱[167]Fig. 2-1 sgRNA Vector map（2）酶切 sgRNA 表达载体按照以下酶切体系，用 Bbs I 酶去酶切 sgRNA 表达载体（见图 2-1），酶切后的产物进行凝胶电泳，切取所需载体条带的胶块，最后通过胶回收试剂盒回收含有粘性末端的 sgRNA表达载体。载体酶切见表 2-2。表 2-2 载体酶切体系Table 2-2 The reaction system of digestion of the vector成分 体积（μL）Bbs I 酶 110x 缓冲液 2sgRNA 载体 1加去离子水至 20（3）干扰片段引物退火按照以下退火体系，加入上下游引物，最后加入去离子水使终体积达到 50 μL，进行退火
蓝色是细胞核（200×）。is Desmin, blue is nucleus（200×）.图 3-1 牛结蛋白免疫荧光染色Fig. 3-1 Immunofluorescence assay of Desmin牛 MDSCs 分化 1 d 后经免疫荧光染色，Desmin 呈阳性。图中显示的in，蓝色为 DAPI 染色的细胞核。Desmin 是 MDSCs 分化结构肌管的主特异性标志。经免疫荧光染色后肌管呈绿色，表明分离的细胞为牛 MGAP1 在牛 MDSCs 分化不同时期中的表达nGAP1 蛋白表达化 0 d，1 d，2 d 和 3 d 的牛 MDSCs，用 Western Blot 实验检测各时期1 和 MYOG 蛋白量的变化情况。件 ImageJ对反应条带进行灰度扫描，计算 RanGAP1及 MYOG与内参基出 RanGAP1 及 MYOG 蛋白在四个时期段的相对表达量结果，见图 3
注：绿色是 RanGAP1，蓝色是细胞核（200×）。Note: Green is RanGAP1, blue is nucleus（200×）.图 3-3 免疫荧光实验检测分化不同时期 RanGAP1 表达量Fig. 3-3 Immunofluorescence assay of RanGAP1 during bovine MDSCs differentiation结果显示：牛 MDSCs 分化 0 d 的时候，没有出现肌管；分化 1 d 时，有少量小型肌管；分化 3 d 时，出现多核大肌管。且分化过程中肌管的亮度也逐渐增加。由此可见，随着牛 MDSCs的不断分化，细胞的融合度逐渐增加，肌管中 RanGAP1 蛋白量逐渐升高。蛋白水平和形态方面可以得出，在牛 MDSCs 分化过程中，RanGAP1 含量逐渐增加。由此可见，RanGAP1 与牛 MDSCs 分化有一定的联系。3.3 RanGAP1 对牛 MDSCs 分化的影响3.3.1 RanGAP1 过表达3.3.1.1 筛选 RanGAP1 过表达效率最高的载体通过 PEI 方法将 sgRNA，sgRNA-R1，sgRNA-R2，sgRNA-R3，sgRNA-R4 分别与 vpr 共同转染牛 MDSCs，转染 24 h 后，利用 Western Blot 实验检测牛 MDSCs 中 RanGAP1 的蛋白
【参考文献】
相关博士学位论文 前1条
1 张伟伟;miR-2400和EGR1对牛骨骼肌卫星细胞分化过程中MyoG基因表达调控[D];东北农业大学;2015年
本文编号：2743827
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/2743827.html
