猪肠类器官模型的建立及干扰素λ在肠道黏膜免疫中抗猪流行性腹泻病毒（PEDV）作用机制的研究

发布时间：2020-07-06 16:07

【摘要】：猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)属于α冠状病毒属,是引起新生仔猪腹泻的主要病因,每年给养猪业造成重大经济损失。猪小肠上皮是PEDV感染的靶细胞,是由绒毛区和隐窝区组成的多种细胞类型的复杂结构。目前用于体外研究PEDV的细胞模型缺乏小肠上皮复杂的生理结构,限制了对PEDV的致病机理和调节宿主天然免疫应答的研究。因此,建立一个能模拟体内小肠上皮的细胞模型尤为必要。随着干细胞技术的发展,体外培养的人或鼠肠类器官能模拟体内肠上皮结构。因此,本研究从猪不同肠段分离肠隐窝干细胞,其能够在体外7天后分化成肠类器官,能重现肠上皮多种细胞类型的复杂结构,且能连续传代和冻存复苏。通过荧光定量PCR(qPCR)和间接免疫荧光(IFA)检测发现小肠类器官对PEDV易感,能产生感染性病毒颗粒(TCID_(50)达10~4/mL)。IFA检测证实PEDV可以感染多种类型的细胞(绒毛上皮细胞、干细胞和杯状细胞)。进一步通过qPCR和IFA检测,发现回肠类器官和结肠类器官表现出不同肠段对PEDV敏感性的差异,与体内结果一致,表明肠类器官保留着宿主遗传特性。本研究还发现临床分离株PEDV-JMS比细胞适应株PEDV CV777在回肠类器官中复制地更好。通过qPCR检测发现PEDV在感染早期抑制回肠类器官中IFN产生,并且在回肠类器官中IFN-λ1比IFN-α诱导更强抗病毒基因的表达(ISG15、MxA、OASL和IFITM1),更有效抑制PEDV感染。Ⅲ型干扰素(IFN-λ)属于IL-10家族成员,主要作用于黏膜上皮细胞。前期研究表明猪IFN-λ3比IFN-α更有效地抑制PEDV感染,但其抗病毒差异的机制尚不清楚,尤其是IFN-λ3诱导的转录谱,还未见报道。为解析猪IFN-λ3抗黏膜病毒的分子机制以及与IFN-α抗PEDV活性的差异,本文通过RNA-seq比较了两种IFN在猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)诱导的基因转录谱,发现IFN-λ3处理IPEC-J2细胞后诱导997个基因差异表达而IFN-α只诱导126个基因差异表达,其中共同诱导差异表达基因110个。转录谱富集分析表明,IFN-λ3比IFN-α参与调控IPEC-J2细胞中更多的细胞组分、分子功能等生物学过程,激活更多的信号通路,尤其是JAK-STAT信号通路。通过qPCR在IPEC-J2和小肠类器官上验证了RNA-seq结果,证实IFN-λ3比IFN-α更有效上调ISGs表达(MX2、IFIT3、OASL、OAS1、RSAD2和PLAC8)。通过克隆表达IFN-λ3诱导前10个基因中的rsad2和mx2基因,证实猪RASD2和MX2呈剂量反应显著抑制PEDV的感染。总之,本研究建立了一种可模拟体内肠上皮的肠类器官模型,为探索PEDV发病机制以及宿主与猪肠道病毒之间相互作用的体外研究提供了一个坚实的平台,也为阐明IFN-λ抗PEDV的分子机制奠定了基础。另外,通过对IFN-λ3和IFN-α诱导的转录谱分析及验证为探索IFN在黏膜免疫中的抗病毒机制提供了理论依据。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.28
【图文】：

图 1.1 PEDV 基因组和病毒粒子结构(Lee, 2015)Fig 1.1 PEDV genome organization and virion structure(Lee, 2015)3 PEDV 感染细胞模型前PEDV的复制和繁殖主要是在来源于非洲绿猴肾脏的Vero细胞上进行(Wangetal

图 1.2 先天免疫信号通路和 PEDV 蛋白的拮抗作用(Koonpaew et al., 2019)Fig 1.2 Innate immune signaling pathways and antagonism by PEDV poteins(Koonpaew et al., 2019)2 肠类器官的研究进展

图 1.3 肠类器官结构模型(Bartfeld, 2016)Fig 1.3 The model of enteroids(Bartfeld, 2016)器官模拟肠道上皮独特的结构微环境为研究肠道病毒的各种生物学方面提供于人轮状病毒（RV）来说，用于培养 RV 的常规体外方法是在稳定的细胞系中繁猴肾细胞（MA104）、人结直肠腺癌细胞（HT-29 和 Caco-2）或原代细胞系，

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本文编号：2743852