乙酰基-L-肉碱对水牛卵母细胞体外成熟影响的研究

发布时间：2020-07-07 03:14

【摘要】：卵母细胞成熟是影响雌性动物繁殖能力的重要因素之一,卵母细胞成熟过程需要消耗大量的能量,脂肪酸的β-氧化是卵母细胞成熟及后续胚胎发育的重要能量来源之一,在卵母细胞成熟及胚胎附植过程中发挥重要作用。乙酰基-L-肉碱(Acety-L-carnitine,ALC)能促进脂肪酸的β-氧化,目前探讨ALC与哺乳动物繁殖性能相关研究尚少,已有的数据证实ALC具有缓解小鼠早期胚胎氧化应激及促进羔羊卵母细胞脂类代谢等功能,但ALC影响水牛卵母细胞体外成熟及相关研究缺乏且机制不清楚。本研究探讨了 ALC对水牛卵母细胞体外成熟及后续胚胎发育的影响,并利用质谱技术初步解析了 ALC影响卵母细胞脂类指纹图谱及代谢液代谢指纹图谱的变化,本文的主要研究结果如下:1.探讨了体外成熟液添加ALC对水牛卵母细胞体外成熟及后续胚胎发育的影响。首先为了确定ALC添加的较佳浓度,试验设计了 0 mM,1.25 mM,2.5 mM和5 mM的不同添加浓度组,结果表明,2.5 mM组所得的囊胚率显著高于其它各组(P0.05)。后续研究以2.5 mM为较佳添加浓度检测ALC影响卵母细胞和卵丘细胞的各评定指标,结果显示,相比不添加组,ALC添加组卵丘细胞具有显著性的增殖能力(P0.05);卵母细胞中ROS含量显著下降(P0.05)及呈均匀线粒体分布的卵母细胞比例显著上升(P0.05);卵母细胞和卵丘细胞中mtDNA含量显著升高(P0.05);E2分泌显著增加(P0.05);ALC组卵母细胞和卵丘细胞中P450scc和GDF9两个基因相对表达量显著高于不添加组(P0.05)。因此,ALC通过降低ROS含量和调节线粒体功能、提高旁分泌因子的表达及增加类固醇分泌,促进水牛卵母细胞体外成熟及后续胚胎发育。2.通过超高效液相色谱-质谱联用技术(Ultra Performance Liquid Chromatography mass spectrometry,UPLC-MS),探讨了 ALC 对水牛卵丘卵母细胞复合体的代谢液代谢指纹图谱影响。利用OPLS-DA多元分析方法分析质谱数据,筛选出7种显著性差异代谢物,其中Dopaxanthin(与抗氧化性相关),O-acetyl-ADP-ribose(Sirtuins基因的中间代谢产物,与抗氧化和抗衰老相关)和Aldosterone 18-glucuronide(类固醇及类固醇衍生物)在ALC添加组的含量显著高于不添加组(P0.05)。而(S)-a-Amino-2,5-dihydro-5-oxo-4-isoxazolepropanoic acid N2-glucoside(葡萄糖苷),Lactose 6-phosphate(乳酸磷酸盐,与葡萄糖代谢相关,参与半乳糖代谢及能量代谢信号通路),Fumaric acid(三羧酸中间物质,参与三羧酸循环及氧化磷酸化信号通路)和D-Glucurono-6,3-lactone(葡萄糖醛酸内酯,葡萄糖代谢产物)在ALC添加组的含量显著低于不添加组(P0.05)。因此,在水牛卵丘卵母细胞复合体体外成熟过程中,添加ALC下调了卵丘卵母细胞复合体糖代谢相关代谢产物,上调了抗氧化代谢及类固醇生成相关代谢产物。3.通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技术,探讨了 ALC对成熟卵母细胞脂类指纹图谱的影响。利用OPLS-DA多元分析方法分析质谱数据,筛选出3个脂类离子(m/z 728.7[PC(32:3)],768.8[PC(P-36:3)]和894.9[TAG(58:8)])在ALC添加组卵母细胞中含量显著低于未添加组(P0.05)。经Nile Red染色对各组卵母细胞总脂含量进行测定,结果显示ALC添加组总脂含量显著低于未添加组(P0.05)。因此,在水牛卵母细胞体外成熟过程中,添加ALC可显著降低成熟卵母细胞总脂含量,并降低了磷脂离子和甘油三酯离子的含量。4.利用分子生物学和MALDI-TOFMS技术探讨了 ALC对成熟卵母细胞冷冻效果的影响。利用O2PLS-DA多元分析方法分析质谱数据,结果显示,与未添加冷冻组相比,ALC组可显著提高冷冻解冻后孤雌激活胚胎的分裂率、桑椹胚率、囊胚率及解冻后卵母细胞的线粒体膜电位(P0.05),并得到了 5种显著变化的磷脂离子(m/z 728.7[PC(32:3)],746.9[PC(32:5)],760.6[PC(34:1)],768.8[PC(P-36:3)]和 782.6[PC(36:4)];P0.05)在新鲜未添加组含量显著高于未添加冷冻组;3种磷脂离子(m/z 734.6[PC(32:0)],760.6[PC(34:1)]和 782.6[PC(36:4)];P0.05)在 ALC 添加冷冻组含量显著高于未添加冷冻组。因此,在水牛卵母细胞成熟过程中,添加ALC可通过维持线粒体膜电位和磷脂含量促进解冻后体外成熟卵母细胞后续胚胎发育效果。总之,本研究结果说明ALC通过调节线粒体功能、旁分泌因子及类固醇激素表达和脂类代谢,促进水牛卵母细胞体外成熟及后续胚胎发育。本研究结果能为今后深入诠释ALC影响水牛卵母细胞成熟过程中生殖生物学功能相关研究提供参考。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823.83
【图文】：

－ｕ－Ｎ－三甲基赖氨酸。３－羟基－６－Ｎ－三甲基赖氨酸醛缩酶（酶３）分裂为３－轻基－６－三甲基赖逡逑氨酸甘氨酸加４－Ｎ－三甲基氨基丁醛进一步脱氢制备４－Ｎ－二中氨基Ｔ酸酯（４－三甲氨基丁逡逑醛，也称ｙ－丁基甜菜碱）脱氢酶（酶４）（图１－１）。在这个反应的酶中，ｙ－丁基甜菜碱羟逡逑化酶是一种不存在于心脏和骨骼肌，而在人肝脏、睾丸和肾脏中高表达一种酶［６］。素食逡逑者身体中，Ｌ－肉碱（Ｌ－ｃａｍｉｔｉｎｅ，ＬＣ）生物合成率约为１．２（ａｍｏｌ／ｋｇｗｅｉｇｈｔ／ｄ［７１。杂食性动逡逑物的身体中，ＬＣ的合成率为２？１２邋ｐｍｏｌ／ｋｇ邋ｗｅｉｇｈｔ／ｄ，占身体肉碱来源的７５％［８］。肾脏再逡逑吸收和饮食摄入肉碱的变化均不影响内源性肉碱合成速率［９］。口服肉碱的生物利用度只逡逑有１４％到１８％剂量，未被吸收的肉碱大多被大肠中的微生物降解掉［１＜）］。逡逑１逡逑

－ｕ－Ｎ－三甲基赖氨酸。３－羟基－６－Ｎ－三甲基赖氨酸醛缩酶（酶３）分裂为３－轻基－６－三甲基赖逡逑氨酸甘氨酸加４－Ｎ－三甲基氨基丁醛进一步脱氢制备４－Ｎ－二中氨基Ｔ酸酯（４－三甲氨基丁逡逑醛，也称ｙ－丁基甜菜碱）脱氢酶（酶４）（图１－１）。在这个反应的酶中，ｙ－丁基甜菜碱羟逡逑化酶是一种不存在于心脏和骨骼肌，而在人肝脏、睾丸和肾脏中高表达一种酶［６］。素食逡逑者身体中，Ｌ－肉碱（Ｌ－ｃａｍｉｔｉｎｅ，ＬＣ）生物合成率约为１．２（ａｍｏｌ／ｋｇｗｅｉｇｈｔ／ｄ［７１。杂食性动逡逑物的身体中，ＬＣ的合成率为２？１２邋ｐｍｏｌ／ｋｇ邋ｗｅｉｇｈｔ／ｄ，占身体肉碱来源的７５％［８］。肾脏再逡逑吸收和饮食摄入肉碱的变化均不影响内源性肉碱合成速率［９］。口服肉碱的生物利用度只逡逑有１４％到１８％剂量，未被吸收的肉碱大多被大肠中的微生物降解掉［１＜）］。逡逑１逡逑

在内的血清代谢物同时存在于卵泡液中，但含量较低［８１］。在ＣＯＣｓ发育的微环境里，逡逑即卵泡液中存在着大量的甘油三脂和游离脂肪酸，脂肪酸在ＣＯＣｓ发育过程中发挥重要逡逑的作用（图１－３）。逡逑８曍逦＇’\l邋Ｃ＾ｒ邋＇邋—逡逑Ｏ邋v|逦翁逦■，一，逡逑：：逡逑Ｉ：邋：逦幽邋ｅ＿ｅ＿ｅｒ逡逑ＴｒｉａｃｙｌＱｌｙｃｅｒｏｌ逡逑图１－３游离脂肪酸在卵丘－卵母细胞复合体中的利用和分解示意图［８２］。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ｐｒｏｐｏｓｅｄ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋ｏｆ邋ｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ邋ｏｆ邋ｆｒｅｅ逡逑１０逡逑

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本文编号：2744565